Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Analyse fonctionnelle
Dominance récessivité
Test de complémentation fonctionnelle
Sauvetage d’un mutant
Régulation de l’expression des gènes
Régulation par épissage alternatif
Bilan fonctionnel d’une cellule
Interaction entre gènes non homologues
Rôle fonctionnel de l’ADN non ORF
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Bilan fonctionnel d’une cellule

 

Comment comparer les gènes en activité d’une cellule à différents moments physiologiquement différents ?
Nous prendrons comme exemple deux cultures d’une même souche de levure cultivées l’une dans des conditions aérobies et l’autre dans des conditions anaérobies. Les gènes exprimés sont transcrits en ARNm. C’est donc le contenu global d’ARNm de chaque type de cellules qu’il faut comparer. Quelque soit l’ARNm il doit être complémentaire d’une région de l’ADN génomique de levure (le génome complet a été séquencé et analysé, il comprend de l’ordre de 6000 ORF). Pour pouvoir faire un bilan sur tous les gènes on va utiliser des puces à ADN

* Sonde : une partie de chaque ORF aura été fixée en un point de la puce (donc 6000 points).
* Préparation des produits à analyser : l’ARN est extrait de chaque culture et l’ARN polyA purifié. On synthétise l’ADNc en le marquant par un fluorochrome, Cy3 (fluorescence verte) pour la première culture, Cy5 (fluorescence rouge) pour la seconde culture.
* Les deux préparations d’ADNc marqués sont mélangés et mis au contact de la puce pour hybridation. Chaque ADNc se fixe là où il trouve la séquence qui lui est exactement complémentaire. Puis la puce est lavée pour éliminer l’excès d’ADNc non fixé.
* La révélation se fait sous le microscope en photographiant la puce après excitation au laser pour révéler les points qui ont fixé le Cy3, puis une seconde fois pour révéler le Cy5. Ces clichés sont sauvegardés sous forme d’images que l’on superpose. Les points de la puce qui n’ont fixé que de l’ADNc Cy3 apparaissent verts, ceux qui n’ont fixé que le Cy5 sont rouges et ceux qui ont fixé les deux sont jaunes. L’intensité de chaque point est fonction de la quantité de Cy (donc d’ADNc) fixé.


Figure 5-27. Exemple d’hybridation des 2 ADNc au niveau de trois points de la puce.

 

Figure 5- 28. Analyse par superposition des images obtenues en excitant le Cy3 puis le Cy5.

La figure 3-16 montre l’image d’une puce (avec un seul fluorochrome). Dans le cas du génome de levure on a étudié les 6116 gènes identifiés sur la séquence complète ainsi que 96 zones intergéniques et il a fallu inclure des contrôles. L’ensemble a donné 707520 points de dépôts répartis en 110 puces. L’impression du résultat tel que dans la figure 3-16 (mais avec les deux Cy) a demandé 52h.
Le traitement informatique de ces images permet de tracer le profil des différences entre deux états (ou deux tissus différents du même organisme.


 

Figure 5- 29. Comparaison des niveaux d’expressions des gènes dans deux tissus différents

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