Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Analyse fonctionnelle
Dominance récessivité
Test de complémentation fonctionnelle
Sauvetage d’un mutant
Clonage fonctionnel d’un gène de levure
Clonage fonctionnel d’un gène humain.
Régulation de l’expression des gènes
Rôle fonctionnel de l’ADN non ORF
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Clonage fonctionnel d’un gène humain.

 

 

De nombreuses voies métaboliques présentent de grandes analogies dans l’ensemble du monde vivant, en particulier chez la levure et l’homme on trouve

-des voies de biosynthèse d’acides aminés
-des voies de biosynthèse de nucléotides
-la voie de réparation de l’ADN (analogie entre des gènes dont une mutation confère XP chez l’homme et une incapacité à réparer l’ADN chez la levure)
-de nombreuses étapes du cycle cellulaire
-les processus de réplication, de transcription et de traduction ; etc.

Pour sélectionner un gène d’un organisme dans un autre, il faut qu’il s’y exprime. Il existe une différence importante entre levure et homme : chez la levure la plupart des gènes sont d’une seule pièce alors que chez l’homme ils sont pour la grande majorité morcelés. Pour qu’un gène humain s’exprime chez la levure il est prudent de ne pas demander à l’organisme receveur de faire lui-même l’épissage. La solution à ce problème est de partir d’une banque humaine d’ADNc dans laquelle les exons des gènes sont déjà assemblés.
La région promoteur n’est pas incluse dans l’ADNc. Il est donc nécessaire de la mettre dans le vecteur au préalable. La lecture d’une phase ouverte sans codon Stop risque de se prolonger par une lecture de l’ADN plasmidique qui dénaturerait la protéine, il est donc prudent de mettre à coté du site d’insertion d’un coté un promoteur et de l’autre un terminateur. Le vecteur doit pouvoir se multiplier dans la levure (organisme de sélection) mais également chez la bactérie (organisme de production de l’ADN plasmidique), on prendra donc un vecteur navette.
Enfin il faut choisir comme souche de levure réceptrice des plasmides recombinés un (ou plusieurs) mutant conditionnel du gène dont on recherche l’analogue humain. Si ce préalable n’est pas satisfait on ne pourra pas utiliser ce procédé de sélection.

Connaissances préalables

La régulation de la transcription se fait par l’intermédiaire de protéines qui se fixent sur des séquences CCAAT.
Des études biochimiques ont montré qu’il y avait des ressemblances fortes entre ces protéines chez la levure et chez l’homme.
Chez la levure on connaît 3 gènes qui codent de telles protéines. Une mutation dans l’un d’eux rend la souche mutée incapable d’utiliser un substrat uniquement respirable tel que le lactate :mutants [lact-].

 


Figure 5- 22. Construction de la banque d’ADNc humain.

Figure 5- 23. Sélection des rares clones portant un gene capable de sauver la souche mutante de levure incapable de métaboliser le lactate.

 

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