Université Pierre et Marie Curie

Génétique

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Levure

Mutants de la voie de l’Arginine

Figure 5- 1. Biosynthèse de l’arginine chez la levure.
Chez la levure la souche sauvage est prototrophe, elle n’a pas besoin d’arginine pour pousser car elle sait la synthétiser à partir de la source carbonée (sucre) fournie par le milieu. On a isolé de nombreux mutants qui ont perdu cette indépendance vis à vis de l’arginine : ils ne savent plus la synthétiser et il faut en ajouter dans le milieu pour qu’ils puissent pousser. Ils sont de phénotype [Arg-]. Comparée à eux le phénotype de la souche sauvage s’écrira [Arg+]

 

On a 3 mutants M1, M2, et M3 qui sont tous de phénotype [Arg-]. Chacun va être croisé par avec des cellules de la souche sauvage [Arg+].
Le croisement est effectué sur milieu complet pour permettre la croissance de toutes les cellules puis tous les clones sont répliqués sur milieu minimum et milieu plus arginine.

Figure 5- 2. Résultat des croisements souche de référence x mutant.

Dans les 3 cas le croisement est de même type, haploïde prototrophe par haploïde auxotrophe. Mais le résultat n’est pas toujours le même. Avec M1 et M2 les diploïdes sont prototrophes alors que pour M3, le diploïde est auxotrophe. Les trois mutations ne sont donc pas toutes de la même nature. Dans les deux premiers cas c’est le phénotype sauvage qui l’emporte, c’est le phénotype dominant alors que dans le troisième c’est le phénotype mutant. On dit alors que le phénotype mutant est dominant (ou que le phénotype sauvage est récessif).
Dire qu’un phénotype est récessif signifie qu’il est masqué lorsque le second allèle confère un phénotype dominant.
Un phénotype dominant masque l’expression d’un phénotype récessif.

Remarque : on n’a révélé la différence de phénotype qu’en choisissant soigneusement le milieu. Sur un milieu complet (la boite matrice) ou supplémenté en arginine, on ne fait pas la différence entre les mutants et la souche de référence tous haploïdes ni entre les diploïdes. Le phénotype est le résultat de l’interaction des nombreux gènes et allèles en présence ainsi que du milieu.

Figure 5- 3.Les trois étapes de l’étude de l’addition de 2 génomes.

 

 

Dans le cas du mutant M2, l’interprétation sera la même, avec comme seule différence que,  comme on n’a aucune indication sur le gène muté de chacun de ces mutants et que vraisemblablement il existe plusieurs gènes qui confèrent le phénotype [arg-] (Figure 5-1), on appellera le gène B au lieu de A.
Pour M3 l’interprétation est différente puisque le phénotype [arg-]conférée par sa mutation est dominante sur le phénotype [Arg+]. Le croisement s’écrit de la même façon en utilisant par mesure de précaution un autre nom de gène C.

Explication moléculaire

La connaissance actuelle que l’on a des mécanismes de la voie métabolique de l’arginine et de sa régulation permettent d’expliquer ce qui se passe dans une cellule diploïde.
Chaque étape biosynthétique est catalysée par une enzyme qui est codée par un gène distinct. Dans un milieu supplémenté en arginine une souche sauvage arrête la synthèse endogène de cet acide aminé. On a pu montrer que la synthèse des enzymes de cette voie étaient réprimée par une protéine (codée par un gène, évidemment) active lorsqu’elle est complexée à l’arginine. Lorsqu’elle est dans un milieu sans arginine elle est inactive en temps que répresseur (Figure 5-4 à 5-6).

 

 

Figure 5- 4. Le phénotype mutant est récessif devant le phénotype sauvage qui s’exprime.

 

 

Figure 5- 5. Modèle de régulation de la biosynthèse des enzymes bio synthétiques de l’Arginine.


Figure 5- 6. Le phénotype mutant est dominant : il masque le phénotype sauvage.

 

 

Dans le cas du mutant M3 on a montré que le répresseur protéique qui à l’état sauvage est inactif a une mutation qui le rend toujours actif. Chez le mutant il est donc toujours actif et même en milieu sans arginine la cellule est réprimée pour la synthèse de cet aminoacide.


Résistance à la canavanine

La souche sauvage est sensible à la canavanine et on a isolé 3 mutants C1, C2 et C3 résistants à cet analogue. Chacun a été croisé avec la souche sauvage sensible et chaque diploïde a été mis à pousser en parallèle sur deux milieux l’un avec et l’autre sans canavanine. Ceux qui poussent en présence de canavanine sont marqué + dans le tableau 5-1.

Tableau 5- 1. Test de dominance/récessivité pour la résistance à la canavanine.

Les mutants C2 et C3 présentent un phénotype résistant récessif devant le phénotype sensible conféré par l’allèle de la souche sauvage.
Le mutant C1 a un phénotype résistant dominant sur le phénotype sensible de la souche sauvage.
Comment cela se passe-t-il au niveau du cytoplasme ?
La toxicité de la canavanine est due à l’intégration de cet analogue à la place de l’alanine (voir figure 4-14) dans les protéines. Avant d’être intégré dans les protéines, la canavanine doit pénétrer dans le cytoplasme. Sa pénétration est assurée par la perméase qui permet la pénétration de l’arginine. Ensuite son intégration dans les protéines se fait par l’intermédiaire d’un ARNt-Ala qui est chargé en canavanine par l’Alanyl-ARNt synthétase. En présence de canavanine (et d’alanine au moins d’origine endogène), la synthétase confond alanine et canavanine. Les protéines sont donc en partie composées de canavanine à la place d’arginine et donc inactivées. Il n’y a plus suffisamment de chaque protéine active pour que la cellule puisse survivre. La résistance est acquise par une diminution de la fraction des protéines qui contiennent la canavanine. Ce résultat est atteint si la perméase, par mutation, a une affinité diminuée pour la canavanine mais inchangée pour l’arginine (cas des mutants haploïdes [CanR] C1 et C2). Lorsque la souche diploïde est construite entre une souche haploïde sauvage et un des deux mutants, elle comporte pour l’Ala ARNt Sase deux formes du gène, l’une qui code une synthétase sensible et l’autre qui code une forme résistante. Les deux synthétases coopèrent également à charger l’ARNt-Ala, donc une fraction va encore incorporer la canavanine à la place de l’arginine. Si la proportion finale de protéines intactes (sans canavanine) est supérieure à une valeur limite (70%) le diploïde sera encore résistant ([CanR] dominant sur [CanS]) sinon, il sera sensible ([CanR] récessif devant [CanS]).

Tableau 5- 2. Mécanisme de résistance à la canavanine.

De l’ensemble de ces deux expériences on doit retenir deux choses essentielles.
Qu’il est impossible de prévoir si un phénotype est dominant ou récessif par rapport à un autre.
Seule l’expérience permet de donner une réponse.

 

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