Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Analyse fonctionnelle
Dominance récessivité
Test de complémentation fonctionnelle
Sauvetage d’un mutant
Clonage fonctionnel d’un gène de levure
Clonage fonctionnel d’un gène humain.
Régulation de l’expression des gènes
Rôle fonctionnel de l’ADN non ORF
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Clonage fonctionnel d’un gène de levure

 


Chez la levure on a isolé dans les années 1970 des mutants qui poussent à 25°C mais incapables de donner des colonies à 37°C (ce que sait faire la souche sauvage). Les mutants ont été classés en groupes de complémentation qui sont nombreux. On a ensuite voulu isoler les gènes correspondants.
Dans une première étape on a préparé une banque d’ADN génomique d’une souche de référence de levure dans un plasmide comportant une origine de type levure et un gène de sélection u+ (un mutant du gène U est auxotrophe vis à vis de l’uracile [Ura-], voir chapitre 2). La banque contient plusieurs milliers de vecteurs recombinés tous différents.
Sélection du clone : on transforme une culture de cellules portant une mutation dans le gène U (elle est donc [Ura-] et une autre dans le gène A qui rend sa croissance thermosensible : à 37°C la cellule s’allonge mais est incapable de se diviser. Elle ne forme donc pas de colonies. On utilise une concentration telle qu’il y ait environ un plasmide par cellule transformée.
La sélection des cellules va se faire en deux temps.

1. on étale les cellules sur milieu sans uracile à 25°C : seules les cellules qui ont reçu un plasmide sont capables de pousser. On en trouve de l’ordre de 104.
2. On fait alors une réplique des clones obtenus qui sont mis à pousser à 37°C toujours sur milieu sans uracile. Il ne pousse alors que quelques clones (moins de 10). Ce sont ceux qui ont reçu un plasmide recombiné portant sur le fragment d’ADN étranger l’allèle a+ (voir figure 5-20).

Figure 5- 21. Sélection fonctionnelle d’un plasmide portant un gène d’intérêt

 

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