Université Pierre et Marie Curie

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Détection indirecte

 

Détection indirecte

Dans d'autres cas si l'on connaît le gène dont une mutation est responsable du phénotype [malade], on n'a pas identifié la mutation. Il est donc impossible de la détecter. Dans de tels cas on va chercher un marqueur qui permettra d'identifier le chromosome (la portion de chromosome proche du gène) qui porte l'allèle muté pour déterminer si c'est lui qui a été transmis au descendant. Pour pouvoir connaître l'état de cette portion du génome des parents il faut avoir examiné un malade de la même famille (enfant de la même fratrie, ascendant , cousin, ...)

Phénotype dominant

L'aniridie est une malformation de l'oeil qui est dépourvu d'iris. Cette malformation s'accompagne de perte sévère d'acuité visuelle. C'est une maladie rare (1 naissance sur 100 000. La figure 8-6 permet de déduire que ce phénotype est dominant sur le phénotype normal et que le gène concerné est autosomique.

Figure 8- 7.Pedigree d'une famille présentant plusieurs cas d'aniridie.

De nombreuses mutations sont la cause de ce défaut. Elles affectent un gène important dans le programme de développement des organismes multicellulaires (Pax6 localisé sur le bras court du chromosome 11, bande 13). Il ne peut donc être question de repérer chaque mutation individuellement. La stratégie de diagnostic prénatal suivie dans ce cas a été de trouver un marqueur polymorphe (un RFLP qui présente 2 formes) suffisamment proche de Pax6 pour que l'on puisse raisonnablement négliger la faible probabilité de Crossing Over entre le site RFLP et le site de la mutation. Puisque les deux sites n'ont qu'une probabilité très faible de recombiner, tous les gamètes fournis seront de type parental. On détermine quel est le génotype du parent atteint pour ce marqueur et le gène Pax6. L'examen du génotype de l'embryon permet de dire quel chromosome 11 lui a été transmis.

Figure 8- 7. Région du chromosome 11 contenant le gêne Pax6 et le site polymorphe AvaI.

Dans la famille de la figure 8-8 un second enfant est attendu. Sera-t-il atteint d'aniridie ? Chaque personne de la famille a été testée pour l'état du site AvaI . Pour cela , on a prélevé un peu de sang. Des globules blancs on a extrait l'ADN total. Celui-ci a subi une digestion complète par AvaI. Tous les fragments obtenus ont été classées par ordre de taille avec une électrophorèse sur gel d'agarose. Les fragments d'ADN ainsi rangés sont transférés sur membrane de nylon (Southern Blot) afin que l'on puisse les hybrider avec la sonde unique marquée S1(de l'ordre de 300bp). Parmi le million (valeur approximative) de bandes résultant de la digestion par AvaI, seules celles qui ont une séquence identique à S1 vont retenir la sonde par hybridation. Sur une autoradiographie elles seules seront détectées. On saura donc si le sujet testé présente une bande de 6,5kbp (le site polymorphe est absent sur les deux chromosomes homologues) ; une bande de 4kbp (le site polymorphe est présent sur les deux chromosomes homologues) ou les deux bandes (le site polymorphe est absent sur l'un et présent sur l'autre)

 

Figure 8- 8. Diagnostic prénatal de l'aniridie. A: pedigree de la famille, B : analyse du site polymorphe très proche du gène Pax6, C : reconstitution des deux chromosomes 11 homologues paternel et maternel reçus par II-1, D : reconstitution des deux chromosomes 11 portés par la mère.

II-1 qui porte un site AvaI présent et un absent (Av+/Av-) ne peut avoir reçu Av+ que de sa mère. C'est également elle qui lui a fourni l'allèle muté Pax6-. On peut donc écrire son génotype .

La mère a pour phénotype [aniridie , bandes 4 et 6,5]. Elle est donc hétérozygote pour le gène pax6 (pax6-/pax6+) et pour le site polymorphe (AvaI-/AvaI+). En l'absence d'informations supplémentaires il y a deux façons possibles d'écrire son génotype, deux phases pout le site polymorphe et le gène : . Sachant ce que son premier enfant a reçu d'elle (AvaI+, pax6-) permet d'éliminer la première possibilité puisque site polymorphe et gènes sont si proches qu'un CO entre eux est très improbable.

Un tel test nécessite que le parent porteur de la maladie soit hétérozygote également pour le site polymorphe examiné, ce qui n'est pas toujours le cas (n'oubliez pas que ce site polymorphe n'a rien à voir avec la maladie, il est juste à côté du gène concerné)

Maladie liée à l'X

Hémophilie A

C'est le cas de l'hémophilie de type A (déficience en facteur VIII, voir la figure 8-9).

Figure 8- 9. Cascade de la coagulation

Au début de la pratique du diagnostic prénatal on avait déterminé que le gène F (codant pour le facteur VIII) dont des mutations sont responsables de l'hémophilie A et un marqueur RFLP (DX13) mis en évidence par digestion avec Bgl II puis hybridation avec la sonde unique DX13, étaient assez étroitement liés (moins de 5% de CO entre les deux).

 

Figure 8- 10.Positions respectives du gène F et du marqueur RFLP DX13 (on le désigne par la sonde qui permet de le révéler).

 

Dans la famille V ( voir figure 8-11), la fille III-2 dont le frère est hémophile souhaite savoir si elle est porteuse. Pour tenter de lui répondre on effectue une analyse génétique basée sur la liaison relativement étroite entre le gène F et le site S de coupure de Bgl II (au moment de l'interrogation, la carte des RFLP en était à son commencement et on ne disposait pas d'autre marqueur polymorphe plus proche et utilisable dans cette famille).

Le fils III-1 a pour génotype :

Il a reçu son unique chromosome X de sa mère dont on peut préciser le génotype complet et la phase :

Quant à la fille III-2 elle a reçu de son père f+ Bg+ et de sa mère le chromosome X qui porte Bg- et donc aussi f+ (en supposant qu'il n'y a pas eu de CO, puisqu'ils sont rares). Son génotype complet est donc : . Elle n'est pas porteuse.

Figure 8- 11. Pedigree de la famille V.

Figure 8- 12. Détermination du phénotype des membres de la famille V pour le site polymorphe DX13.

Après 1985, date du clonage du gène F et de sa cartographie complète, on a trouvé d'autres marqueurs RFLP situés à l'intérieur des 180 kbp qui contiennent les 26 exons de la phase codante. Le même test que précédemment a été répété dans cette famille en utilisant un de ces sites polymorphes (p114) mis en évidence par une digestion par Bcl I et hybridation avec la sonde intronique p114.

figure 8- 13 Analyse de la famille V avec le marqueur RFLP p114

Cette fois, les génotypes des quatre membres vivants de la famille sont les suivants:

La fille est porteuse saine. C'est en effet ce diagnostic qui est le meilleur car le repère utilisé est plus proche du site mutationnel que celui utilisé précédemment. On est ici, avec le RFLP DX13 dans le cas rare où on a pu observer un crossing over entre le repère DX13 et la mutation que l'on cherchait à localiser.

 

Figure 8- 14.Le chromosome X avec les sites Bg, Bc et le gène F.

Figure 8- 15.Les deux chromosomes X de II-1 et le crossing over qui a généré le chromosome qu'elle a légué à sa fille III-2.

Figure 8- 16Chromosome maternel remanié hérité par III-2.

 

Une telle erreur est inhérente à la méthode, puisqu'au lieu de regarder directement la mutation, on regarde un autre point qui est proche mais non confondu avec elle. On s'efforce le plus possible de minimiser le risque de cette méthode en choisissant des repères les plus proches possible du gène important. Dans l'exemple ci-dessus, le premier repère utilisé était ce que l'on avait de moins éloigné lors de la première consultation, mais qui s'est avéré trop éloigné pour être fiable. Depuis on a pu montrer que le gène F et la sonde DX 13 sont séparés par 5 unités de recombinaison, ce qui, actuellement n'est plus considéré comme une liaison suffisante pour faire un diagnostic prénatal fiable. De toute façon, ce type de méthodes indirectes comporte toujours une part de risque due à la possibilité de CO entre le repère et la mutation indétectable directement. On s'efforce seulement de diminuer ce risque le plus possible en choisissant le marqueur le plus lié génétiquement possible.

 

Phénotype récessif, gène autosomique

Granulomatose septique

La granulomatose septique est une maladie du système immunitaire. C'est une maladie héréditaire qui est transmise sur le mode récessif autosomique. Elle se manifeste par des infections graves et répétées, bactériennes et mycéliennes et des inflammations chroniques comme gingivites, inflammation des ganglions ou masses tumorales appelées granulomes qui ne sont pas malins. Ils peuvent cependant provoquer de sérieux problèmes en obstruant le passage des aliments dans l'oesophage, l'estomac, et les intestins comme en bloquant le flux urinaire des reins à la vessie.

Figure 8- 17. Pedigree d'une famille présentant des cas de Granulomatose septique (CGD).

Un gène est impliqué dans cette famille. Il est localisé sur le chromosome 22 très proche du marqueur RFLP EcoRI. La sonde D22S451 permet de révéler ce RFLP (voir figure 8-18).

 

Figure 8- 18.Le gène impliqué dans la CGD et le site RFLP proche.

Un couple a déjà un enfant atteint de CGD (même gène que celui impliqué dans la figure 89-17) et souhaite savoir si le second le serait également. Une analyse d'ADN sur les deux parents , l'enfant malade et sur le foetus (prélèvement de tissu embryonnaire au niveau des villosités du chorion) a donné les résultats de la figure 8-19.

Figure 8- 21. Analyse de l'ADN des membres de la famille A.

L'enfant atteint est homozygote pour l'allèle muté du gène en jeu (a1/a1) ainsi que pour le site polymorphe (e+/e+). Son génotype s'écrit donc sans ambiguïté : . Les deux chromosomes homologues sont identiques l'un venant du père et l'autre de la mère. Les deux parents sont hétérozygotes pour les allèles du gène A. Ils présentent les deux bandes 3,5 et 4,8 kbp et sont donc également hétérozygotes pour le site polymorphe. Puisqu'on connaît un de leur chromosome (celui qu'ils ont légué à leur premier enfant) on peut écrire leur génotype sans ambiguïté :pour le père, et pour la mère . Si l'on exclut l'éventualité d'un Crossing Over entre le site polymorphe et la mutation dans le gène A (probabilité trop faible), chaque parent ne fournit que deux types de gamètes (parentaux). On peut prévoir les types de descendants possibles de ce couple.

L'examen précédent montre que seuls les descendants ne présentant que la bande 4,8kbp seront également homozygotes pour l'allèle muté du gène A. Cette prévision est valable à condition qu'il n'y ait pas de crossing over entre le site e et le site muté de l'allèle a1.

Qu'aurait-on pu conclure si le premier enfant avait été hétérozygote pour le site e et de génotype Les génotypes parentaux auraient été sans pouvoir préciser lequel était paternel et lequel était maternel (ce qui n'est pas grave puisqu'il s'agit d'un gène autosomique). Le tableau de gamètes devenait le suivant.

Dans ce cas la prévision ne peut être complète puisque deux descendants présentant le même polymorphisme au site EcoRI (bandes 3,5 et 4,8 kbp) auront deux phénotypes différents [sain] ou [CGD] résultant des formes du gène A qu'ils auront héritées. Pour pratiquer un tel diagnostic indirect il est indispensable

  • que les parents hétérozygotes pour les allèles du gène concerné soient également hétérozygotes pour le marqueur polymorphe
  • mais aussi que la phase (association d'un allèle du site polymorphe avec un allèle du gène concerné)soit la même pour les deux parents

Lorsqu'on utilise un marqueur biallélique du type RFLP, la probabilité de trouver un hétérozygote varie en fonction de la fréquence de chaque allèle et ne dépasse jamais 50%.
Soit p la fréquence avec laquelle le site est coupé (état 1) et q celle avec laquelle il n'est pas coupé.
p+q = 1
Dans la population il n'existe pour ce site polymorphe que 2 formes possibles de gamètes.

 

Les hétérozygotes ont donc une fréquence de 2pq dans la population générale.

Figure 8- 18. Variation de la fréquence des hétérozygotes en fonction de la fréquence des allèles, dans le cas d'un marqueur biallélique.

 

Microsatellites

De plus en plus on utilise de préférence des marqueurs polymorphes multialléliques du type microsatellites (voir CH3 p15). Dans ce cas chaque allèle est caractérisé par un nombre de répétitions du motif qui peut varier de quelques unités à plus d'une centaine (chaque microsatellite a ses propres caractéristiques). On a souvent une dizaine de formes différentes avec chacune une fréquence propre (f1,f2,...fn). La fréquence des hétérozygotes est égale à , qui est souvent élevée (dépasse largement 50%). Etant donné le nombre de formes alléliques différentes il n'est pas rare de trouver des couples (sans consanguinité) qui portent un allèle différent du même microsatellite sur chacun de leurs 4 chromosomes homologues.

 

 

 

Fréquence des hétérozygotes dans la population générale

Dans une autre famille aucun marqueur RFLP n'est utilisable. Par contre, on vient d'identifier un microsatellite proche du gène impliqué (figure 8-21).

Figure 8- 22. Diagnostic prénatal à l'aide d'un microsatellite. A : carte du voisinage du gène impliqué dans la CGD. B : pedigree d'une famille, C : reconstruction des 4 chromosomes parentaux homologues.

Dans cette famille chaque chromosome parental est distinct des autres. On peut déterminer sans ambiguïté le génotype de chacun, sachant que le sujet malade est homozygote pour un allèle muté (a1/a1).

 

tableau comparatif entre RFLP et microsatellitesà la fin du chapitre.

Comparaison RFLP et microsatellites

 

 

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