Université Pierre et Marie Curie

Génétique

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Méthode

 

 

 

Il faut que le gène cloné puisse s'exprimer correctement. Le vecteur dans lequel il est inséré doit donc avoir les caractéristiques d'un vecteur d'expression (posséder des signaux de début de transcription et de fin pour que la synthèse d'ARNm se fasse correctement). Les problèmes d'épissage et de taille (certains gènes génomiques humains dépassent la centaine de kbp)sont résolus en clonant non pas le gène génomique mais l'ADNc. Néanmoins il reste les problèmes de maturation de la protéine après la traduction (glycosylations, méthylations,...) .Dans le cas du facteur VIII (gène impliqué dans un type d'hémophilie) dont le gène a été cloné en 1985, ce problème n'est toujours pas résolu.

Vecteurs

Les vecteurs viraux que l'on utilise actuellement sont soit des rétrovirus qui ne s'intègrent que dans des cellules en division, soit des adénovirus à ADN qui peuvent infecter les cellules qui ne se divisent pas, soit des constructions plus artificielles.

Dans tous les cas on intègre au génome viral une cassette qui contient l'ADNc à exprimer et des séquences régulatrices en 5' et 3' qui permettront son expression dans des cellules de type mammifère.

Les rétrovirus ont un génome d'ARN qu'ils recopient en ADN après infection. Cette copie est intégrée au génome de la cellule hôte grâce aux répétitions terminales. On prépare un virus recombiné où les gènes de réplication (gag-pol-env) ont été remplacés par la cassette contenant le gène d'intérêt. Après reproduction de ce virus défectif, il est injecté aux cellules à transformer où la cassette va s'intégrer au hasard dans le génome propre de la cellule. Cette intégration non ciblée peut être à l'origine de mutations néfastes pour les cellules qui les portent. Si les cellules transformées sont aptes à survivre, leurs descendantes porteront également le gène surnuméraire et le produit de traduction continuera d'être fabriqué pour corriger le défaut génétique. La capacité de tels vecteurs est de 9kbp maximum.

Les adénovirus sont des virus à ADN qui infectent aussi bien les cellules qui ne se divisent pas. Ils ont principalement comme cibles des cellules du système respiratoire. C'est pourquoi on s'en est servi dans la recherche d'une thérapie génique pour la mucoviscidose. Un des gènes essentiel de l'adénovirus est remplacé par la cassette d'expression (capacité maximum 8kbp). L'ADN de ces virus n'est pas intégré au génome de la cellule hôte, ce qui implique la nécessité de traitements récurrents pour maintenir l'infection. Mais il arrive que certaines protéines virales présentent un effet toxique et des problèmes de rejet des cellules infectées sont fréquents

Des parvovirus défectifs sont parfois employés(Adeno Associated Virus). Il faut alors les utiliser avec un virus (type herpes ou adéno) qui vient aider le virus défectif dans sa réplication. La cible peut être constrituée par des cellules qui ne se divisent pas. Les problèmes sont encore ceux inhérents aux protéines virales et à la réaction immunitaire qu'elles risquent de déclencher. La capacité maximum de telles constructions est de 4,5kbp.

Afin d'éviter les problèmes immunitaires on s'est tourné vers des constructions dépourvues de protéines : de l'ADN de type plasmidique qui contient une cassette d'expression (maximum 50kbp) est inclus dans un liposome. La plupart des liposomes reste dans le cytoplasme. La faible proportion qui atteint le noyau s'y maintient sous forme plasmidique. Le rendement de ce type de transformation est très faible.

ADN nu

L'ADN cassette est inclus dans un plasmide bactérien entouré des séquences qui lui permettent une expression dans des cellules de mammifères. Tel quel il est injecté aux cellules à transformer. Les plasmides qui atteignent le noyau s'y maintiennent sous forme plasmidique. L'efficacité est cependant très faible.

Dans l'ensemble des techniques décrites ci-dessus la capacité des vecteurs est limitée ey ne permet que le clonage de l'ADNc. Il est donc impossible d'intégrer l'allèle sauvage du gène d'intérêt avec ses séquences de contrôle naturelles (ce qui peut être une cause supplémentaire de dérégulation cellulaire).

Minichromosome humain

On sait construire depuis un certain temps des chromosomes artificiels de levure (pYAC, voir Chapitre 2). Les chromosomes eucaryotes ont tous comme constituants essentiels

* aux deux extrémités des télomères( répétitions de 5 à 20 kbp d'un petit motif TTAGGG) protégeant les chromosomes d'érosion.

* une région centromérique constitués de motifs répétés. Cette séquence centromérique se fixe aux microtubules cellulaires et assure la répartition correcte des chromatides filles lors des divisions cellulaires.

* une (plusieurs sur les chromosomes naturels) origine de réplication.

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