Université Pierre et Marie Curie

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Typage dun individu

 

 

Chaque être humain se distingue de ses " semblables " par un ensemble de caractéristiques morphologiques et biologiques qui rendent son identification possible.

Les techniques utilisées pour mettre en évidence le polymorphisme de l'ADN permettent aujourd'hui d'obtenir, dans de courts délais, des résultats extrêmement précis à partir d'échantillons ne contenant qu'une quantité infime de produit biologique. Elles imposent, en contrepartie, des précautions rigoureuses pour parer aux risques de contamination qui compromettraient la fiabilité des analyses.

Polymorphismes utilisables

. Le polymorphisme de l'ADN nucléaire

Pour 4 à 5 %, la molécule d'ADN est constituée par les gènes qui sont le support de l'information. Ces unités codantes se retrouvent au niveau de l'ARN messager lors du phénomène de transcription puis se traduisent en protéines.

En revanche, la plus grande partie (95 à 96 %) de l'ADN nucléaire ne commande directement aucune synthèse protéique et l'on ignore actuellement sa fonction précise. Dans cette partie non codante, l'analyse a mis en évidence des régions variables : il s'agit de segments d'ADN caractérisés par la répétition en tandem d'unités de base composées de deux ou plusieurs nucléotides. La taille de ces fragments, ou allèles, varie en fonction du nombre de répétitions. On distingue ainsi deux types de polymorphisme :

1. les mini-satellites ou VNTR (Variable Numbers of Tandem Repeats) correspondent à des motifs répétées en tandem, de 15 à 40 paires de bases. Le nombre de ces répétitions est variable d'un individu à l'autre, constituant une série allélique. Des études récentes considèrent que nous aurions 1 500 zones de ce type, soit 1 500 systèmes de polymorphisme.

2. les micro-satellites ou STR (Short Tandem Repeats), unités répétitives dont le motif est très court (4 paires de bases en moyenne) et répété de deux à dix fois ou plus. Des centaines de micro-satellites ont été étudiés mais, peuvent seuls être retenus pour la pratique des empreintes génétiques ceux

* qui sont aisément amplifiables avec une expression simple des allèles,

* présentent un fort taux d'hétérozygotie

* expriment un nombre d'allèles suffisamment élevé.

Deux points importants doivent être soulignés à propos de cet examen des zones variables :

* plus nombreux sont les sites polymorphes qui font apparaître une concordance entre un échantillon recueilli sur le lieu d'une infraction et un échantillon connu (prélevé sur un suspect), moins il est probable que l'échantillon provienne d'un individu différent.

* La non-concordance constatée sur un seul site polymorphe conduit à écarter de façon absolue l'individu dont le profil ADN est confronté à celui de l'échantillon recueilli.

La certitude de l'identification s'apprécie en termes de probabilité, l'exclusion en termes de certitude.

Le polymorphisme de l'ADN mitochondrial

L'ADN mitochondrial (ADNmt), présent dans le cytoplasme, peut également être utilisé pour l'expertise génétique : il s'agit d'une petite molécule circulaire et monocaténaire de 16 569 paires de bases qui code pour des chaînes polypeptidiques nécessaires au fonctionnement de la mitochondrie et pour des ARN. Sa séquence est entièrement connue et elle présente deux régions hyper variables. Le polymorphisme n'est pas lié ici à des variations de longueur mais à des variations dans la composition en nucléotides (polymorphisme de structure).

Une autre caractéristique de l'ADNmt est son hérédité maternelle. En effet, l'ovule est bien fourni en mitochondries (entre 100 000 et 200 000) alors que le spermatozoïde n'en contient qu'un petit nombre qui ne persistent pas dans la descendance. La mère transmet donc son ADNmt à tous ses enfants mais seules les filles le transmettront à leur tour à leur progéniture.

Par ailleurs, le polymorphisme de l'ADNmt est moins marqué que celui de l'ADN nucléaire et l'analyse qui en est faite est donc moins discriminante. Il présente néanmoins un double intérêt :

* préservé par la haute résistance de la mitochondrie et présent à de nombreux exemplaires dans une cellule (de l'ordre de 50 génomes mitochondriaux pour un seul génome nucléaire), il peut être analysé sur des traces anciennes ou fortement dégradées sur lesquelles l'ADN nucléaire n'est plus exploitable. La recherche historique en a fait ces dernières années un fréquent usage, notamment pour les ossements de la famille impériale de Russie et pour le coeur présumé de Louis XVII conservé à St Denis.

* il peut également permettre d'expertiser des tissus biologiques dépourvus d'ADN nucléaire, mais riches en mitochondries, qui sont prélevés sur une scène de crime. C'est notamment le cas des tiges de cheveux.

Techniques

Analyse par hybridation

Technique utilisée dès 1985 avec des sondes multilocus puis des sondes monolocus. L'ADN est tout d'abord digéré par une enzyme de restriction , ce qui génère de l'ordre d'un million de fragments tous différents. Ces fragments sont triés par ordre de taille par électrophorèse sur gel d'agarose, puis transférés par Southern Blot sur membrane de nylon où l'on peut les hybrider avec différents types de sondes.

Sondes multilocus

Dès 1985 on a utilisé des sondes oligonucléotidiques pouvant reconnaître plusieurs sites dont les séquences d'ADN sont très voisines sur l'ensemble du génome, il est possible, en les rendant radioactives, de faire apparaître les fragments hybridés sur une autoradiographie. Le polymorphisme de taille, différent chez chaque individu, se traduit par la mise en évidence de bandes noires ressemblant à un code-barre dont il faut définir avec précision la taille des fragments. Ces sondes peu spécifiques ont été appelées multilocus.

Figure 8- 24. Empreinte génétique de 5 personnes établie avec une sonde multilocus.

Malgré son très fort pouvoir discriminant, cette méthode a été abandonnée car elle présentait, pour la médecine légale, un certain nombre d'inconvénients :

* lourdeur et longueur de la mise en oeuvre (cinq jours environ),

* nécessité d'une grande quantité d'ADN (une tâche de sang de la taille d'une pièce de cinq francs),

* difficulté, voire impossibilité, d'interprétation en cas de mélanges d'ADN,

* impossibilité de conserver des données pour une interprétation ultérieure.

Sondes monolocus

En 1989, cette méthode fut améliorée par l'usage de sondes monolocus qui utilisent, comme les précédentes, la technique du Southern Blot et étudient le même type de variabilité mais se concentrent sur une seule localisation du génome. L'autoradiographie ne révèle donc qu'un locus représenté par un ou deux allèles selon que le sujet est homozygote ou hétérozygote. Il est possible d'augmenter la puissance de ce test en multipliant les sondes spécifiques.

Figure 8-25.Utilisation de sondes monolocus pour confirmer une filiation.

Cette technologie robuste est peu sensible aux contaminations, très discriminante et d'une interprétation aisée. Elle présente d'autre part l'avantage de permettre un travail sur les mélanges d'ADN, mais elle demeure coûteuse en temps et en personnel et sa faible sensibilité requiert une quantité importante (500 ng au minimum) d'ADN non dégradé et bien purifié. Si elle reste encore employée, dans le domaine civil, pour les recherches de paternité, elle a été supplantée au pénal par la réaction de polymérase en chaîne (PCR) basée sur l'amplification génique.

Analyse par PCR

L'amplification génique est plus facile à réaliser sur des unités répétitives du génome dont le motif n'est composée que de deux à sept nucléotides, les micro-satellites ou STR (Short Tandem Repeats), qui seront localisés sur différents chromosomes et exprimeront un nombre d'allèles suffisamment élevé.

Le nombre de loci étudiés doit être assez élevé pour conférer à l'analyse du profil génétique un pouvoir réellement discriminant. Tous les laboratoires français utilisent aujourd'hui des kits qui incluent une quinzaine de régions du génome sélectionnées par le système américain CODIS pour leur haute valeur discriminante. Sept d'entre eux sont ceux qu'a consacrés la pratique anglaise et qui tendent désormais à être mis en oeuvre par tous les laboratoires européens. Ces kits permettent d'amplifier simultanément plusieurs STR associés à un marqueur sexuel(le gène de l'amélogénine qui chez l'homme est présent sur le chromosome X et avec une addition de 6bp sur le gène Y, ce qui permet de distinguer un ADN d'origine mâle d'un ADN d'origine femelle).

Ce système multiplexe présente, outre son coût réduit et sa rapidité de réalisation, l'avantage de permettre l'analyse sur de très faibles quantités d'ADN (cas fréquent dans le cas de traces prélevées sur des scènes de crime). Il convient cependant d'observer que plus les zones étudiées sont nombreuses, plus les conditions de bonne amplification sont délicates à réunir et plus la réaction est fragile.

Les marqueurs sont révélés, soit de façon manuelle sur gel de polyacrylamide coloré à l'argent, soit de façon automatisée sur un séquenceur avec une détection en fluorescence. Le choix des loci coamplifiés est déterminé par la nécessité d'obtenir des conditions d'amplification homogène et de permettre une lecture simple : les zones de taille des fragments ne doivent pas se chevaucher et des échelles de références possédant toutes les tailles d'allèles doivent être disposées sur le gel tous les deux échantillons.

Cette technique présente de nombreux avantages qui expliquent qu'elle se soit imposée dans tous les laboratoires spécialisés pour l'établissement des profils génétiques :

* Une réaction PCR peut être réalisée sur une très faible quantité d'ADN représentant cinquante à cent cellules, qu'il soit dégradé ou non, purifié ou non, récent ou ancien et, pratiquement, quel que soit le support. Ceci permet d'obtenir des résultats à partir de très petits échantillons et de pratiquer un complément d'expertise avec le matériel restant.

* La méthode est facile à pratiquer, les réactifs pouvant être fournis sous forme de kits prêts à l'emploi.

* Le recours à l'informatique permet d'obtenir le résultat de l'analyse dans un délai très court, avantage décisif dans le cadre d'une enquête judiciaire : douze heures pour une trace de sang, soixante douze heures pour une trace de sperme. Dans le cas d'un prélèvement buccal opéré sur un suspect, ce délai n'excède pas six heures et est donc compatible avec celui de la garde à vue.

La seule faiblesse de cette méthode, liée à sa très grande sensibilité, réside dans le risque de contamination par un ADN étranger, et ce d'autant plus que la quantité d'ADN analysable est réduite. Des précautions draconiennes doivent donc être observées tant au stade du recueil des échantillons qu'à celui de l'analyse.

Toutes les méthodes ci-dessus, qui utilisent des STR, sont applicables à l'ADN nucléaire.

Séquençage

L'analyse de l'ADN mitochondrial vise à mettre en évidence un polymorphisme de structure. La définition du mitotype (type de l'ADNmt) porte sur la détermination d'environ 700 nucléotides par la technique du séquençage. L'utilisation d'un séquenceur automatique permet de raccourcir le délai de réponse.

La séquence déterminée est comparée à une séquence de référence. Les points de mutation sont mis en évidence et les mitotypes permettront, comme pour l'ADN nucléaire, d'affirmer, soit une exclusion (certaine si plus de trois différences sont observées entre les deux ADN), soit une identité (avec une certaine probabilité).

Dans le cas de l'affirmation d'identité, la fréquence du mitotype est déterminée à partir d'une banque de données internationale comportant les séquences de 1657 individus non apparentés. La majorité des séquences déterminées n'existent pas dans cette banque de données. Dans ce cas, l'estimation de la fréquence en cas d'identification est inférieure à 1/1657, soit moins de 0,06 %. Néanmoins, certaines séquences d'ADN mitochondrial sont sur-représentées dans la population générale et leur fréquence peut atteindre 2,8 %. Dans ce cas, on considère que cette fréquence élevée ne permet pas une identification fiable et que seule une exclusion est possible.

Cette technologie est lourde et onéreuse. Comme il s'agit d'une méthode permettant l'analyse de micro-prélèvements, elle est très sensible aux contaminations. Plus encore que pour l'ADN nucléaire, la séparation des activités et la mise en place de nombreux contrôles (extraction-amplification) revêtent une importance particulière pour la validation des résultats.

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