Dans le cas des gènes
Hox, la caractéristique commune est la présence de l'homéoboite
dont la séquence extrêmement conservée est encadrée par
deux zones presque invariables (en AA).
Figure 7- 16. Homéoboite
des gènes de la sous famille Antennapedia.
Cette constance de séquence
protéique a inspiré la stratégie suivante pour la recherche
d'un gène orthologue chez Ciona intestinalis (Coelomate,
Deutérostomien, Chordé, Urochordé, Ascidie). On a une séquence
consensus protéique, (donc sans trace des introns qui pouvaient
morceler le gène génomique). A l'aide du code génétique
on peut déduire la (ou les, puisque le code est dégénéré)
séquence d'ADN correspondante La banque dans laquelle on
a le plus de probabilité de trouver une telle séquence est
donc une banque d'ADN copie. Le code étant dégénéré la séquence
d'ADN qui code ces fragments extrêmement conservés peuvent
être variables (K est codé par 2 codons AAA et AAG). D'autre
part on connaît certaines préférences concernant quelques
gènes déjà séquencés de Ciona quant à l'usage des codons
pour un même aminoacide. On va préparer un mélange des différentes
sondes possibles qui serviront à repérer les clones avec
lesquels il y a une hybridation notable.
Figure 7- 17. Sondes
utilisées pour cribler la banque d'ADNc de Ciona.
Dès qu'un clone d'ADNc
aura été isolé, il pourra à son tour être utilisé pour chercher
dans une banque d'ADN génomique , un clone qui hybride.
Pour cela on prend un fragment de 400bp (environ) que l'on
marque par nick translation (voir chapitre 2) qui sera utilisé
comme sonde.
On ne pouvait pas rechercher
immédiatement un clone d’ADN génomique
avec la sonde oligonucléotidique pour plusieurs raisons.
• Dans un tissu
tous les gènes ne sont pas exprimés en même
temps, donc une banque d’ADNc est moins grande qu’une
banque d’ADN génomique.
• Une sonde hybride d’autant mieux que la
séquence homologue est plus grande, donc les sondes
oligonucléotidiques de 23 bp sont moins discriminantes
que la sonde ADNc de 400bp
• L’ADNc ne comporte pas d’intron donc
on ne court pas le risque que la sonde oligonucléotidique
soit à cheval sur deux portions non adjacentes
; avec la sonde de 400bp, il y aura au minimum une hybridation
de 200bp successives, ce qui est suffisant pour révéler
le clone correspondant.
Figure 7- 18. Stratégie
de clonage du gène Hox5 de Ciona.
