Université Pierre et Marie Curie

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Clonage positionnel

 

 

Lorsqu'on sait à peu près où se trouve un gène, on peut se servir de cette indication pour son clonage.

Dans le cas du gène responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne (ou une forme plus rare et moins grave: la dystrophie musculaire de Becker) les connaissances étaient réduites à sa localisation chromosomique relativement précise sur le bras court du chromosome X en p21 grâce à l'observation de la maladie chez des filles présentant constamment, parmi diverses translocations, la cassure de ce chromosome en p21. L'étude avec des marqueurs RFLP et microsatellites permit d'établir une liaison relativement étroite entre pERT84 et pERT87 encadrant le locus du gène recherché..

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Figure 6- 41.Localisation génétique du gène impliqué dans la DMD.

La première étape du clonage du gène fut la constitution d'une banque enrichie en fragments délétés chez un sujet atteint à la fois de myopathie de Duchenne, de granulomatose chronique, de rétinite pigmentaire et du syndrome de McLeod, présentant une petite délétion de la région Xp21. L'idée ingénieuse de Kunkel (voir ls références à la fin du chapitre) fut de prendre à la fois de l'ADN d'un sujet normal et du sujet multiatteint porteur de la délétion. Les deux ADN devaient après dénaturation et renaturation pouvoir s'apparier l'un sur l'autre sauf dans la région délétée qui n'existait que chez le sujet sain. Il fallait trouver une astuce pour ne cloner que cet ADN renaturé sur lui-même. Puisque pour cloner il faut inclure les fragments dans des vecteurs avec des extrémités cohésives il s'est servi de cette nécessité pour trier entre les différents ADN.

Tout d'abord chaque ADN (lot 1 venant du sujet sain ( En réalité l'ADN provient de cellules en culture issues d'un sujet sain mais qui ont un caryotype anormal: 49 XXXXY. On a donc l'avantage supplémentaire d'avoir la portion intéressante représentée 4 fois plus que la majeure partie du génome mâle.)
Ces étapes sont réalisées dans des conditions un peu particulières qui accélèrent la renaturation des ADN.
lot 2 venant du sujet multiatteint) est purifié et coupé au hasard en fragments d'une taille moyenne de 40 kbp puisque le vecteur choisi est un cosmide.

L'ADN du lot 2 est coupé uniquement par les forces de cisaillement durant les différentes étapes de l'extraction et l'action des ultrasons. Il ne présente donc pas d'extrémités cohésives. L'ADN du lot 1 est fragmenté par digestion partielle par l'enzyme de restriction Mbo I qui génère des extrémités cohésives 5' débordantes GATC. Les deux lots d'ADN sont alors mélangés, dénaturés puis renaturés (Ces étapes sont réalisées dans des conditions un peu particulières qui accélèrent la renaturation des ADN). Seuls les fragments de type 2 ont deux extrémités cohésives 5' débordantes GATC et pourront être ligaturés avec des extrémités du cosmide lui aussi ouvert par Mbo I.. Les produits de cette renaturation sont ensuite ajoutés à l'ADN cosmidique et ligués avant ajout de prétêtes et queues de phage qui permettent l'infection de bactéries par ces cosmides recombinés. La banque ainsi obtenue se présente comme un ensemble de colonies bactériennes (figure 6-42).

L'ADN des clones obtenus est transféré sur nitrocellulose pour être hybridé avec de l'ADN d'un sujet sain ou du sujet multiatteint. On recherche également les clones qui contiennent de l'ADN répété ou unique. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous.

 

nombre de clones testés

total obtenu

125

clones n'hybridant jamais

12

clones d'ADN répété

32

clones d'ADN unique

81

clones d'ADN de chromosome X

18

clones n'hybridant pas avec l'ADN délété

4


Figure 6- 42. Stratégie de clonage du gène DMD.

Par des méthodes cytogénétiques les 4 clones ont été positionnés par rapport à différentes délétions et translocations où le chromosome X étaitimpliqué. Deux de ces clones présentent des caractéristiques identiques: pERT 55 et pERT 145.

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Figure 6- 43. Apport des 4 clones dans la localisation.

Le clonage soustractif a permis d'encadrer de plus près le gène responsable.

A partir des deux amorces pERT55 et pERT154 les auteurs ont choisi de "marcher" sur le chromosome pour rencontrer le gène recherché.

Marche sur le chromosome

On s'est rapproché autant que possible du gène cherché. Il s'agit maintenant, en partant de l'extrémité du segment de le parcourir jusqu'à son autre extrémité. Si l'on y arrive on rencontre forcément le gène cherché pour autant qu'on soit capable de l'identifier.

On dispose de la banque génomique humaine (éventuellement construite sur une lignée cellulaire où le chromosome X est sur représenté: 4 X pour 2 lots d'autosomes) et d'un clone déjà identifié contenant une insertion qui porte le marqueur pERT 54. Ce fragment est extrêmement petit : quelques centaines de paires de bases. En hybridant les colonies de la banque génomique avec cet insert marqué on va repérer des clones plus grands qui contiennent la même région (pERT 54 est de l'ADN unique). On a ainsi isolé un clone dont l'insertion fait 35 kbp. La recherche d'un clone qui contienne une insertion grande, chevauchante avec la première, mais décalée par rapport à celle-ci constitue la première étape de la marche. Pour cela, la première insertion est extraite du cosmide et digérée par un ou plusieurs enzymes de restriction afin d'en établir la carte. Ensuite deux morceaux l'un près d'une extrémité le second près de l'autre extrémité sont sous clonés extraits de leurs plasmides respectifs marqués radioactivement et utilisés comme sonde sur la banque précédente. Dans les cas favorables les clones précédents vont être à nouveau repérés mais d'autres également qui contiennent la nouvelle sonde mais pas l'ancienne. L'hybridation avec la sonde de l'autre extrémité permet de choisir les clones les plus avantageux pour la marche: ceux qui sont le plus décalés avec le premier et qui hybrident avec une extrémité mais pas avec l'autre. S'ils ont à peu près la même taille on a fait un pas

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Figure 6- 44. Marche sur le chromosome.

Le problème d'une telle démarche est que l'insertion peut se faire dans n'importe quel sens et l'on ne sait pas à priori s'il faut partir à droite ou à gauche, on est donc obligé de marcher simultanément dans les deux sens. Cette méthode est longue et laborieuse: de l'ordre de 40 pas pour 106bp. pratiquement on ne parcourt guère plus de quelques kbp par mois. De plus, si au cours de la marche on rencontre un fragment d'ADN répétitif, on ne peut aller plus loin puisqu'il n'y a alors plus de possibilité de sonde unique pour avancer.

Lorsque les différents fragments sont clonés ordonnés et séquencés il reste à identifier le gène (pour lequel on n'a aucune donnée). On recherche une ou plusieurs phases de lecture non interrompues par des non-sens, qui se rencontrent fréquemment en dehors des phases codantes. D'autres indices peuvent aider à la reconnaissance. Dans le cas de la DMD la région clonée s'est avérée délétée dans l'ADN d'un grand nombre de patients. Ce gène couvre une très grande distance (2,3.106bp). En tenant compte du fait que les gènes codants divergent moins rapidement entre espèces différentes que les zones non codantes, on a recherché dans la région clonée les sous régions qui hybridaient plus fortement avec de l'ADN d'espèces de plus en plus éloignées (technique dite du zoo-blotting).

Les premiers exons furent détectés de cette manière, ce qui a permis d'isoler un ARNm de 14 kbp correspondant à la transcription de ce gène (composé de 79 exons). Dans ce cas (comme dans d'autres) au lieu de partir de la protéine comme dans le cas des globines ou du facteur VIII, on suit la démarche inverse: ignorant tout de la protéine c'est par la position du gène que l'on va atteindre son produit. On parle alors de génétique inverse.

 

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