Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Préparation de l’ADN à cloner
Les vecteurs
Plasmides
Bactériophage
Cosmides
Chromosomes artificiels
Ligation
Banque d’ADN génomique
Utilisation des fragments clonés
Les gènes
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Chromosomes artificiels

pYAC

Les chromosomes artificiels (ou minichromosomes) sont des structures qui copient les chromosomes de la cellule hôte eucaryote et se répartissent régulièrement lors des divisions, comme les chromosomes naturels. On y retrouve donc les éléments essentiels des chromosomes :

  • une origine de réplication qui est en phase avec les origines chromosomiques naturelles.
  • une région centromérique qui assure la migration correcte du minichromosome
  • un site unique de clonage
  • un ou plusieurs marqueurs de sélection (un par élément constitutif).

Ces chromosomes artificiels ont une capacité très augmentée d'accepter de l'ADN étranger (voir le tableau 2-4). On en a construit pour les bactéries : Bacterial Artificial Chromosome (BAC), pour la levure, YAC et on est en train d'en mettre au point pour les mammifères, MAC.

A titre d'exemple voyons la constitution d'un plasmide YAC XE "plasmide YAC" . C'est un vecteur navette puisqu'il peut se répliquer aussi bien dans une cellule de levure que dans une cellule bactérienne. A l'état natif c'est un plasmide circulaire qui comporte de l'ADN de deux origines

  • de pBR 322 il a reçu l'origine bactérienne de réplication (colE1) et le gène de résistance à l'ampicilline.
  • des chromosomes de levure il a reçu une origine de réplication chromosomique : Autonomous Replication Site (ARS), qui assure la reproduction de l'ADN dans une cellule de levure ; une région centromérique chromosomique (CEN). Il a aussi deux régions télomériques d'origine chromosomique qui protégeront les extrémités du minichromosome après recombinaison. Chaque partie du pYAC porte un marqueur de sélection utilisable dans la levure : ce sont les formes fonctionnelles de gènes qui codent des enzymes nécessaires dans la synthèse d'acides aminés ou de bases azotées.

* allèle u+ du gène U qui confère le phénotype [ura+] à un mutant (u-)

* allèle a+ du gène A qui confère le phénotype [ade+] à un mutant (a-)

* allèle h+ du gène H qui confère le phénotype [his+] à un mutant (h-)

* allèle t+ du gène T qui confère le phénotype [trp+] à un mutant (t-)

pic010.gif

Figure 2-21. Carte d'un plasmide YAC.

 

Une double digestion de ce plasmide par BamHI et Sma libère trois fragments : l'un contient h+, ARS et CEN ainsi qu'un télomère, le second contient u+ et un télomère et le troisième uniquement h+. Ces fragments étant de taille différente on peut les séparer par électrophorèse sur gel d'agarose et récupérer les deux premiers que l'on mélange avec des gros fragments à intégrer ayant des extrémités cohésives compatibles. Après action de la ligase on a un minichromosome recombiné qui a perdu h+ mais qui possède encor t+ et u+. Par contre il a perdu a+ car ce gène est maintenant interrompu par l'ADN étranger

Figure 2-22. Le mini chromosome après ligation.

Il faut choisir une souche de levure portant des mutations qui inactivent les gènes a, h, t et u. Elle présentera 4 auxotrophies [ade-, ura-, his-,trp-]. Après avoir reçu un pYAC natif ou un minichromosome, les cellules transformées seront devenues [trp+, ura+]. Si elles ont reçu un pYAC natif elles seront également [his+, ade+] et si elles ont reçu un minichromosome recombiné elles seront [his-, ade-,trp+,ura+]. La combinaison de ces 4 marqueurs permet de distinguer ce qu'a reçu chaque clone cellulaire.

pic011.jpg

Figure 2-23. Construction d'une banque avec un YAC comme vecteur.

Un des problèmes que l'on rencontre souvent avec les YAC c'est que sur un même minichromosome on trouve des gènes de l'ADN étranger qui ne sont pas voisins dans l'organisme d'origine. C'est que 2 fragments non contigus ont été intégrés dans le minichromosome. On parle alors de chimère car l'image que l'on a de l'ADN de la banque ne reflète pas celui de l'organisme de départ.

Figure 2-24. Formation d'une chimère.

pBAC

Le projet de séquençage du génome humain a été commencé à l'aide de YAC mais pour éviter ce genre de problème les BAC ont peu à peu remplacé les YAC qui ne sont actuellement presque plus utilisés.

Les BAC sont des ADN circulaires, comme un chromosome bactérien, dont l'origine de réplication est issue de l'épisome sexuel F de E. coli.

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Figure 2-25. Exemple de chromosome artificiel bactérien, BAC.

OriS est l'origine de réplication de l'épisome F. Les gènes parB et parA également de l'épisome servent à la répartition correcte du plasmide dans les cellules filles. Le gène repE code l'enzyme de réplication spécifique de l'épisome. CosN vient du bactériophage lambda. Ce site est reconnu et ouvert par la terminase in vitro. CmR d'origine plasmidique code la résistance au chloramphénicol. Ce plasmide est à faible nombre de copies (comme le facteur sexuel F).

 

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