Université Pierre et Marie Curie

Génétique

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Caractérisation des clones

 

 

Les clones peuvent être distingués les uns des autres par leurs caractéristiques physiques (la taille par exemple) mais c'est bien insuffisant. Il faut avoir des renseignements sur le degré de ressemblance ou de dissemblance des fragments clonés. Pour cela deux outils sont utilisables : l'hybridation et les cartes de restriction.

 

Hybridation

L'ADN est naturellement sous forme double brin et peut être dénaturé en simples brins par la chaleur.. Si deux brins complémentaires dénaturés sont mis à refroidir ensemble dans des conditions de vitesse et de salinité définies, ils vont se réapparier. Si deux brins presque complémentaires(juste une petite fraction de leur séquence ne remplit pas cette condition de complémentarité) le réappariement se fera également mais dans des conditions un peu moins strictes (on dit souvent stringentes). L'appariement entre deux brins qui ne proviennent pas de la même double hélice est l'hybridation entre ADN différents. Ce degré d'hybridation XE "hybridation" est proportionnel à la ressemblance des deux simples brins.

Pour réaliser une expérience d'hybridation d'ADN il faut avoir un lot d'ADN (un mélange) et un fragment d'ADN. Le fragment est-il représenté dans le mélange ? Si oui, le fragment va s'hybrider avec le mélange dénaturé. Pour visualiser l'hybridation du fragment il faut être capable de repérer celui-ci en y fixant une molécule repérable

  • soit un Phosphore radioactif (marquage au 32P ou 33P) en 5' à la place du P normal (que l'on retire à l'aide d'une phosphatase) à l'aide d'une kinase. La révélation se fera alors par autoradiographie.
  • soit une molécule de fluorochrome, toujours en 5' et par voie chimique. La révélation se fera par excitation du fluorochrome qui émettra une lumière mesurable de longueur d'onde donnée.
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Figure 2-27. Marquage terminal au 32P

Le mélange d'ADN (trié par ordre de taille ou non) est tout d'abord fixé sur une membrane de nylon.

On fait ensuite tremper cette membrane et l'ADN fixé dessus dans un bain de tampon qui contient les molécules de sonde marquées libres.

On dénature les deux types de molécules en chauffant l'ensemble, puis on incube à température plus basse pour permettre la renaturation lorsqu'elle est possible. Une partie de l'ADN fixé va évidemment se renaturer sur lui-même mais si la sonde a une séquence complémentaire à une portion de l'ADN fixé, des molécules de sonde vont également hybrider avec l'ADN fixé.

Figure 2-28. Les différentes étapes de l'hybridation d'un mélange d'ADN.

On lave ensuite la membrane afin d'éliminer la sonde radioactive non hybridée.

Par autoradiographie on regarde si de la sonde a été retenue après lavage. Dans ce cas la pellicule photographique est impressionnée. Cela indique qu'une partie des molécules radioactives ont été retenues sur la membrane par les liaisons H qui se font faites au cours de l'incubation entre l'ADN fixé et la sonde.

Lorsqu'on cherche seulement à savoir si une séquence donnée est présente dans un (ou plusieurs) mélange, on peut éviter cette étape et faire des tests en goutte. le principe est le même : l'ADN est fixé puis hybridé avec une sonde marquée. Après lavage on regarde si des molécules de sonde ont été retenues sur le filtre.

Figure 2-29. Hybridation en goutte.

L'ADN dans lequel on recherche une analogie avec la sonde peut avoir été digéré au préalable par une enzyme de restriction. En général, dans ce cas on trie les fragments obtenus par ordre de taille en pratiquant une électrophorèse en gel d'agarose. Il faut alors transférer l'ADN de l'agarose sur la membrane de nylon sans déranger l'ordre des bandes. Ce transfert est réalisé à l'aide de papier buvard (blotting paper). C'est une manipulation de " Southern blot ".

 

                                                        Figure 2-30. Dispositif de Southern blot.

 

 

Dans la figure 2-30 le tampon pompé par la pile de papier absorbant monte de la cuve placée sous la plaque de verre jusqu'au poids, entraînant avec lui l'ADN qui sort de l'agarose ; mais les fibres d'ADN sont arrêtées par la membrane nylon poreuse (pores trop petits pour qu'il traverse). l'ADN parcourt le chemin de la flèche .

Figure 2-31. Expérience d'hybridation d'ADN avec un southern blot.

 

Cartes de restriction

Un clone peut également être caractérisé rapidement par sa carte de restriction.

On digère séparément l'ADN par deux enzymes de restriction. S'ils trouvent plus d'un site ils génèrent plusieurs fragments dont on ignore l'ordre de succession. Pour lever cette inconnue on fait une digestion par les deux enzymes à la fois. On trouve des fragments qui, réassociés doivent correspondre à ceux obtenus dans les simples digestions.

Figure2-32. Détermination de la carte de restriction d'un fragment linéaire d'ADN.

 

 

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