Université Pierre et Marie Curie

Génétique

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Fragmentation de l’ADN

 

 

 

Lors de l'extraction l'ADN a été soumis à des forces de cisaillement et se trouve déjà fragmenté. La figure 2-3 montre que la taille de ces fragments peut aller de plusieurs dizaines de kb jusqu'à quelques kb (canaux 5 à 8). Or nous le verrons un peu plus tard, un vecteur est capable de véhiculer des fragments d'une taille définie. Si l'on prenait l'ADN tel quel, de nombreux fragments seraient exclus du seul fait de leur taille. On va donc recouper l'ADN de façon aléatoire avec des endonucléases.

Les enzymes de restriction

Une enzyme de restriction est une enzyme qui coupe un double brin d'ADN en un point précis. On parle d'endonucléase XE "endonucléase" car elle coupe à l'intérieur au lieu de dégrader l'ADN à partir des extrémités libres (exonucléases XE "exonucléases" ). Ces enzymes ont été mises en évidence chez les bactéries et leur nom évoque le microorganisme dont elles sont extraites : EcoRI vient d'Escherichia coli souche R, 1ère enzyme isolée dans cette souche. Il existe plusieurs types d'enzymes de restriction. Celles de type II sont les mieux connues et les plus utilisées. Une enzyme de restriction est caractérisée par la séquence du site reconnu, et la position de la coupure.

Figure 2-4 présentant les trois sortes de coupures générées par des enzymes de restriction de type II. HaeIII génère de extrémités sans simple brin dépassant : des bouts francs  ; PstI et BamHI génèrent des extrémités simples brins susceptibles de s'apparier avec d'autres simples brins en suivant la règle de complémentarité des bases, ce sont des extrémités cohésives (« bouts collants  »). PstI a une extrémité 3' qui déborde alors que BamHI en a une 5'

 

Des enzymes de restriction différentes peuvent générer des extrémités cohésives compatibles (capables de s'apparier).

 

Tableau 2-1 Enzymes qui génèrent des extrémités cohésives identiques et donc compatibles même si elles n'ont pas toutes le même site de reconnaissance. Plusieurs enzymes ont l'air identiques, la seule différence est l'organisme dont on les a extraites.

 

Les sites reconnus par de nombreuses enzymes sont palindromiques c'est à dire que les bases du site rencontrées sur un brin de 5' vers 3' sont identiques à celles de l'autre brin lu également de 5' vers 3' . Néanmoins ce n'est pas une loi générale certains sites ne le sont pas. Les enzymes se distinguent par la taille du site reconnu, or plus le site est court plus la probabilité de le rencontrer dans une séquence sera grande.

un palindrome est un ensemble de mots qui prennent le même sens lu de la gauche vres la droite ou de la droite vers la gauche : madam I am Adam ; élu par cette crapule.

Figure 2-5 Taille moyenne des fragments générés par une enzyme de restriction

 

taille du site reconnu

fréquence du site

taille moyenne des fragments

4

(4/1) 4

256bp

6

(4/1) 6

4096bp

7

(4/1)7 4

16 384bp

8

(4/1) 8

65 536bp

Tableau 2-2. Taille des fragments générés en fonction de la taille du site d'une enzyme de restriction .

 

Figure 2-6. Quelques enzymes de restriction. On a actuellement isolé de l'ordre de 200 enzymes de restriction qui reconnaissent un site donné et coupent l'ADN précisément en un point de ce site (Enzymes de type II, les enzymes de type I coupaient à distance du site de reconnaissance et étaient de ce fait bien plus délicates d'emploi ).

 

Figure 2-7. Découverte des enzymes de restriction (1965).

Couper au hasard

Comment à l'aide de ces enzymes faire des coupures au hasard puisque leur propriété est justement de couper en un point précis ?

D'autre part il ne faut pas perdre de vue que les fragments seront reproduits à l'aide de vecteurs dont la capacité d'intégrer de l'ADN est limitée. Les fragments doivent avoir une taille moyenne assez homogène de 20kb (cette taille moyenne peut varier selon le vecteur, voir ci-dessous : les vecteurs).

La solution réside à couper de nombreux génomes identiques (on part de grandes quantités d'ADN)rarement par une enzyme de restriction qui a un site fréquent. Prenons comme exemple Sau3A qui coupe toutes les 256 bp. Pour n'avoir une coupure en moyenne que tous les 20kbp on va mettre une quantité d'enzyme très faible (digestion partielle) qui ne pourra couper qu'un site sur 78 (1/78 = 256/20 000).

Parmi tous les sites Sau3A disponibles c'est le hasard qui fera que l'un sera coupé et pas d'autres. Le résultat de cette digestion partielle peut se résumer en 3 points.

•  Les fragments ont tous des extrémités différentes. Chacun est donc unique

•  Les fragments peuvent se chevaucher, ce qui sera très intéressant lorsqu'il s'agira de les ordonner.

•  Si l'on s'intéresse à un (ou plusieurs) gène, parmi tous ces fragments il y en a certainement un qui le portera tout entier et qui pourra restituer sa fonction.

 

 

Figure 2-8. Digestion partielle.

A schéma du génome complet avec tous les sites Sau3A, le rectangle figure un gène d'intérêt. B la digestion est très partielle. Un site sur 78 est coupé. Plusieurs génomes sont ainsi digérés. Les fragments générés ont tous des extrémités différentes. Parmi tous les fragments, la probabilité d'avoir un fragment qui porte le gène d'intérêt non morcelé est forte. Les différents fragments sont chevauchants.

Pour le but que nous nous sommes fixé (fragmentation au hasard, seul les enzymes de restriction sont nécessaires. Néanmoins il y a d'autres nucléases qui peuvent être fort utiles dans certains cas.

 

Autres nucléases

On distingue les exonucléases qui n'attaquent l'ADN que par une extrémité libre 3' (exonucléase III) ou 5' suivant l'enzyme et les endonucléases comme celles vues précédemment qui attaquent l'ADN en effectuant une coupure interne. Il y a également des nucléases spécialisées dans la dégradation de l'ADN simple brin et d'autres pour l'ADN double brin. D'autres enzymes sont spécifiques et ne dégradent que l'ARN , ce qui est bien pratique lorsque l'on veut lors d'une extraction d'acides nucléiques d'un tissu ou d'un organisme ne garder que l'ADN (en effet certaines réactions enzymatiques que l'on peut faire avec l'ADN sont inhibées par l'ARN)

Tableau 2-3. Différentes nucléases.

La nucléase S1 est particulièrement utile lorsque l'on veut transformer une extrémité débordante en extrémité franche pour la religuer avec un fragment d'ADN dont les extrémités ne sont pas compatibles. Les fragments 1 et 2 présentent respectivement comme extrémités cohésives GC et AA Ces deux extrémités ne sont pas compatibles: on ne peut pas religuer le fragment 1 avec le fragment 2. Pour refaire une liaison covalente entre ces deux fragments on va d'abord les rendre bouts francs par action de la nucléase S1:

Figure 2-10. Action de la nucléase S1 sur des bouts collants

Les fragments 1' et 2' sont maintenant prêts pour être recollés par action d'une ligase.

Cette même nucléase S1 permet également dans un hybride imparfait (ADN/ADN ou ADN /ARN) d'éliminer les portions d'ADN non appariées.

Dans des hybrides ADN/ARN la RNase H permet d'éliminer spécifiquement le brin d'ADN.

 

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