L'état des connaissances
en 1978
Chez les mammifères il existe
deux familles de globines qui s'associent pour former l'hémoglobine
(2 molécules de type 
et deux de type 
.
Les gènes fonctionnels ne sont pas les même au cours de
la vie.
Tableau 2-10. Les différentes
hémoglobines humaines.
Les chaînes
et 
ont une
séquence primaire très ressemblante de 141 aminoacides.
Les chaînes ,
, 
et
sont également
très ressemblantes. Il y a 10AA différents entre
et (sur 146)et
37 entre et
.
Figure 2-43. Période d'expression
des différents gènes de globine
Les cellules de la moelle,
qui sont à l'origine des globules sanguins, donnent des
réticulocytes. Ce sont des cellules anucléées caractérisées
par un réseau interne formé d'ARN cytoplasmique qui disparaît
dans les 24h pour être remplacé par les globines (98% du
contenu cellulaire). Ces réticulocytes ont un contenu fortement
enrichi en ARNm spécifique des globines
et .
Figure 2-44.Etapes de la
formation d'un érythrocyte.
Stratégie de clonage
Figure 2-45. Stratégie pour l'isolement des clones d'ADNc globine
Résultats
En 1978 on n'avait pas encore
mis au point le plasmide pBR322. Le plasmide de clonage
est ici pMB9.
Il a fallu examiner de l'ordre
de 1 200 clones pour en récupérer 4 susceptibles de porter
de l'ADNc de globine. En effet, en l'absence d'un second
marqueur permettant de repérer directement les vecteurs
recombinés, la plupart de ceux qui avaient transformé les
bactéries étaient des vecteurs non digérés ou religués sur
eux-mêmes.
L'ADN plasmidique de ces
quatre clones a été soumis à plusieurs essais pour déterminer
ce qu'ils portaient réellement.
Vérification
On tente d'abord d'estimer la taille de chaque plasmide recombiné. La migration d'un fragment d'ADN peut s'estimer par comparaison de sa mobilité dans un champ électrique avec celle de fragments de taille connue (ADN de l digéré par une enzyme de restriction connue, par exemple). Cela est vrai pour les fragments linéaires, mais les petits ADN circulaires sont en formes plus ou moins super-enroulées (torsion de la double hélice sur elle-même), ce qui leur fait prendre une conformation globulaire (comme lorsqu'on torsade un élastique et qu'il se pelotonne sur lui-même) qui migre plus rapidement puisque moins encombrante. Chaque type de molécule avec un nombre donné de supers-tours a une vitesse de migration propre et à un même plasmide vont correspondrent plusieurs conformations de la molécule. On pourrait envisager de faire une digestion du plasmide pour le linéariser, mais comme c'est un ADN recombiné et qu'on n'a aucune indication sur les sites de restriction de l'insert (Fragment d'ADN étranger), on ne peut pas choisir une enzyme qui n'a qu'un site dans le plasmide recombiné. Les auteurs de ce premier clonage de gène humain ont choisi de prendre comme repère les caractéristiques de migration de la forme la moins rapide pour chaque plasmide non digéré, en espérant que la conformation serait à peu près la même pour tous. Après électrophorèse en gel d'agarose ils ont obtenu le résultat de la figure ci-dessous
Figure 2-46. Vérification de la taille des plasmides obtenus.
On constate que le plasmide du clone 3 migre comme le plasmide non recombiné pMB9, il ne porte qu'un tout petit insert ou pas d'insert du tout . Quant aux clones 1, 2 et 4 leur taille est sensiblement supérieure à celle du plasmide natif, ils ont donc un insert qui peut être intéressant (puisqu'on est parti d'une source d'ARNm qui contenait 98% de ce que l'on recherche).
On a ensuite voulu identifier la séquence de l'insert pour chaque clone. Plusieurs expériences étaient envisageables:
* Par hybridation avec des ADNc purifiés d' ou de globine (il faut faire une électrophorèse de ces ADNc séparés en gel dénaturant de polyacrylamide pour avoir une séparation acceptable car leurs tailles sont très voisine) marqués radioactivement. Les clones dont le plasmide a un insert de globine doit retenir plus de radioactivité lorsqu'il est hybridé avec cette espèce d'ADNc qu'avec l'autre.
* En digérant les plasmides par diverses enzymes de restriction, il doit bien y en avoir quelques unes qui vont faire apparaître des bandes différentes de celles obtenues avec le plasmide natif.
Chacune de ces méthodes a été utilisée.
L'ADN plasmidique de chaque clone est préparé et fixé sur deux membranes. Chaque membrane est incubée soit avec de l'ADNc d' globine, soit avec de l'ADNc de globine marqués radioactivement. Après rinçage la radioactivité retenue par chaque membrane est comptée à l'aide d'un compteur à scintillation.
ADN plasmidique du clone n° |
% de radioactivité retenue avec l'ADNc |
% de radioactivité retenue avec l'ADNc |
1 |
65 |
6 |
2 |
4 |
51 |
3 |
0 |
0 |
4 |
4,5 |
84 |
pMB9 |
0 |
0 |
On peut voir avec le témoin du plasmide seul pMB9 la radioactivité retenue de façon aspécifique. Dans le cas présent cette valeur est nulle: il n'y a aucun bruit de fond. Le clone 3 a les mêmes caractéristiques que pMB9, il ne contient pas d'insert. le clone 1 retient beaucoup plus d'ADNc de type , il doit contenir un insert d'ADNc de type alors que les clones 2 et 4 ont eux un insert d'ADNc de type . Il faut remarquer que les clones présentent tous les trois une certaine hybridation croisée avec l'autre type d'ADNc. Il y a deux raisons à cela:
* les ADNc ne sont probablement pas parfaitement séparés par l'électrophorèse en gel dénaturant de polyacrylamide compte tenu de la faible différence entre eux;
* même si cette séparation était parfaite il y a suffisamment d'homologie de structure entre les deux molécules pour qu'il y ait un peu d'hybridation croisée.
Les clones ne retiennent pas toute la radioactivité correspondant à leur type: lors de la renaturation il y a compétition entre les brins du clone et les brins marqués de l'ADNc. Néanmoins ces résultats sont une bonne indication du contenu de chaque clone.
Le plasmide natif présente un site unique pour EcoR I, utilisé pour y inclure l'insert. Les plasmides recombinés doivent donc avoir perdu ce site là (par contre il peut en avoir d'autres dans l'insert lui-même. BamH I est aussi présent en un seul exemplaire dans pMB9, et a été conservé dans le plasmide recombiné mais il peut y en avoir d'autres dans l'insert. Les ADN plasmidiques de chacun des quatre clones est digéré d'une part par EcoR I et de l'autre par BamH I.
On constate que le clone 3 donne exactement les mêmes bandes que pMB9. Pour les clones 1,2 et 4 certains sites sont d'origine plasmidique alors que d'autres étaient portés par l'insert.
clone |
sites dus à pMB9 recombiné |
sites dus à l'insert |
conclusion |
témoin pMB9 natif |
1 BamH I |
1 EcoR I non perdu car non recombiné |
vecteur natif |
3 |
1 BamH I |
1 EcoR I non perdu car non recombiné |
vecteur natif |
1 |
1 BamH I |
1 EcoR I porté par l'insert |
insert avec 0 site BamH I et 1 EcoR I |
2 et 4 |
1 BamH I |
1 EcoR I et 1 BamH I portés par l'insert |
insert avec 1 site BamH I et 1 EcoR I donc différent du clone 1 |
La dernière expérience pour identifier ces inserts est leur séquençage. Les séquences pour les inserts des clones 2 et 4 sont les mêmes et lorsqu'on essaie de traduire les nucléotides en acides aminés, on met en évidence une phase de lecture non interrompue( phase ouverte de lecture ou ORF pour open reading frame) qui correspond à la séquence protéique de la globine. la séquence de l'insert du clone 1 traduite donne la séquence protéique de l' globine.
Après cette première étape les mêmes auteurs ont cherché le gène génomique codant pour chacune de ces deux protéines.
La banque génomique humaine a été construite avec un vecteur l gt11 ( l d'insertion). Elle contenait de l'ordre de 10 5 à 10 6 clones.
La stratégie de repérage des clones contenant le gène génomique était l'identité de séquence sur les exons. Les inserts des clones 1 et 2 précédemment isolés ont été marqués radioactivement avec du 32 P et ces sondes ont servi pour hybrider les séries de clones de la banque génomique.
Il a fallu hybrider 300 000 clones d'ADN génomique pour obtenir un clone contenant le gène de la globine.
