Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Préparation de l’ADN à cloner
Les vecteurs
Plasmides
Bactériophage
Cosmides
Chromosomes artificiels
Ligation
Banque d’ADN génomique
Utilisation des fragments clonés
Les gènes
L’analyse des génomes
Recherche de gènes
Polymorphisme
Mutagenèse
Analyse fonctionnelle
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Les vecteurs

 

Les fragments obtenus sont dépourvus de moyens de se répliquer(origine de réplication) et d'extrémités protégées. Il est donc nécessaire de les inclure dans une structure qui assurera leur propagation et leur protection. Ces structures sont appelées des vecteurs.

vecteur natif lorsqu'il ne contient que son ADN propre.

Vecteur recombiné lorsqu'il a intégré un fragment d'ADN étranger, quel qu'il soit.

Une origine de réplication est adaptée au mode de réplication de la cellule dans laquelle se multiplie le vecteur. Les différentes cellules (procaryotes, eucaryotes) ayant divergé depuis des millions d'années, les modes de réplication ont divergé et sont actuellement assez différents. Une origine de réplication de type eucaryote ne fonctionnera pas dans une bactérie et réciproquement. Lorsque l'on veut passer d'un type de cellule à l'autre il faut des vecteurs qui possèdent les deux types d'origine de réplication (ils peuvent coexister sans problème). De tels vecteurs sont dits vecteurs navette XE "vecteurs navette" .

Le contrôle d'une origine de réplication peut être rigoureux et dans ce cas le vecteur est répliqué à une vitesse comparable à celle du reste du génome ; on a donc une (ou peu de) copie du vecteur par cellule. Dans tous les cas on a cherché des origines de réplication moins strictement controlées et on les a trouvées. Alors il peut y avoir accumulation de copies de vecteur dans une seule cellule, ce qui peut présenter certains avantages (ou inconvénients). Chaque origine devra donc être caractérisée pour ces deux paramètres (organisme de propagation, nombre de copies accepté).

Pour protéger des extrémités d'ADN deux moyens existent.

  • créer à chaque extrémité un bout collant compatible avec l'autre et religuer les deux extrémités l'une avec l'autre. On obtient un cercle d'ADN sans extrémités libres. C'est ce qui est réalisé dans les plasmides, chez le bactériophage lambda (() ,chez les cosmides, BAC (chromosome artificiel bactérien) de E. coi et PAC de P1 (chromosome artificiel du bactériophage P1).
  • On peut artificiellement coller aux extrémités de l'ADN linéaire des télomères d'origine chromosomique qui assureront la protection des bouts, c'est la voie suivie pour la construction des chromosomes artificiels (pYAC de la levure, pMAC des mammifères, pHAC de l'homme).

Ces différents plasmides se distinguent par leur capacité à accepter de l'ADN étranger.

Vecteur de clonage

Taille de l'insert

Plasmide bactérien standard à grand nombre de copies

0-10 Kb

Bactériophage à insertion

0-10 Kb

Bactériophage à remplacement

9-23 Kb

cosmides

30-44 Kb

BAC (chromosome bactérien artificiel)

jusqu'à 300 Kb

YAC (chromosome artificial de levure)

0.2-2.0 Mb

Tableau 2-4. Différents vecteurs et taille de l'insert accepté.

 

  Plasmides
  Bactériophage
  Cosmides
  Chromosomes artificiels
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