Finalement il faut déterminer la séquence des différents fragments insérés. Quelque soit la méthode utilisée, on ne peut, en une seule expérience déterminer plus de 500bases de long . Une méthode assez utilisée est de refragmenter chaque fragment et de les insérer dans un nouveau vecteur (plasmidique car ces sous fragments sont petits), entre deux séquences connues de l'ADN (on parle alors de sous clonage).

Principe

La détermination de la séquence se fait de façon enzymatique avec une ADN polymérase.

Afin de fournir une amorce acceptable à la polymérase on prépare un petit morceau d'ADN (18 à 25 nucléotides)ou oligonucléotide complémentaire d'une des deux séquences connues, avec une extrémité 5'P, qui peut être marquée (radioactivement ou par fluorochrome) ou non et une extrémité 3'OH. On mélange l'ADN matrice et les molécules d'oligonucléotides avec tampon et désoxynucléotides triphosphate (dNTP). On dénature l'ensemble et on ajoute la polymérase. Cette préparation est partagée en 4 fractions. A chacune on ajoute une faible quantité d'un didesoxynucléotide triphosphate (ddNTP) qui peut être intégré dans l'ADN comme un dNTP mais est bloqué en 3' et ne permet pas la poursuite de la molécule sur les brins qui l'ont intégré.

Figure 2-33 comparaison des molécules de ddTTP et dTTP.

Dans le tube où on a mis dTTP et ddTTP,chaque fois que la polymérase est en face d'un A elle va utiliser soit un dTTP (probabilité 99% ou un ddTTP (probabilité 1%). 0 chaque A de u brin matrice, une fraction des nouvelles molécules va être terminée. Par électrophorèse sur un gel dénaturant à haute résolution (gel de polyacrylamide) on va déterminer la taille des fragments terminés. A l'extrémité 3' de chaque on sait qu'il y a un ddT. Pour déterminer les autres bases on fait la même chose dans les trois autres tubes avec A, G et C. La comparaison des électrophorèses des produits des 4 tubes permet de restituer la séquence du brin matrice

 

figure 2-34. séquençage manuel

 

Automatisé

Le séquençage est de plus en plus automatisé. Le principe reste le même mais le marquage et le mode de détection sont différents. Ce sont les ddNTP qui sont marqués avec un fluorochrome. Chaque ddNTP porte un fluorochrome qui émet dans une gamme de longueur d'onde différente de celle des autres. Il est donc possible de repérer individuellement les quatre types dans marquages dans un mélange, c'est comme si chacun était peint d'une couleur différente. On mélange comme précédemment l'ADN matrice, l'amorce, les dNTP la polymérase et dans le même tube les quatre ddNTP marqués. Il n'y a qu'un tube dont le contenu est soumis à électrophorèse. Au bout du gel 4 capteurs (un par longueur d'onde différente) enregistrent la lumière émise par les molécules terminées par un ddNTP. Ces quatre graphes sont superposés et un logiciel traduit ce pictogramme en séquence.

Figure 2-35. Séquençage automatique.

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