Université Pierre et Marie Curie

Génétique

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Génes et génomes
Préparation de lADN à cloner
Les vecteurs
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Utilisation des fragments clonés
Les gènes
Lanalyse des génomes
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Facteur VIII
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Facteur VIII

 

Ce gene a été isolé en 1985. De nombreuses tentatives avaient déjà été faites en vain. L'isolement de ce gène suscitait de nombreux espoirs d'avancée thérapeutique dans le traitement de l'hémophilie.

L'état des connaissances en 1985

•  Une équipe avait entrepris à des fins thérapeutiques l'isolement de la protéine du facteur VIII. Avant de travailler sur du matériel humain, ils avaient essayé de mettre au point la technique de purification sur des tissus de buf. Le facteur VIII est produit en très petite quantité et on ne connaît pas de cellules ou tissu spécialisé dans sa production (et qui en seraient plus riches). Il a donc fallu utiliser de grandes quantités de foie de buf (plusieurs dizaines de kg) pour extraire, purifier et séquencer cette protéine. Or le séquençage des protéines est une technique laborieuse, longue et délicate d'interprétation. Cette approche s'est finalement soldée par un échec puisqu'au terme de ces travaux il n'a été possible que d'obtenir des quantités infimes de protéine pure, insuffisamment pour déterminer toute la séquence. On n'avait que des fragments extrêmement petits (pas plus de 18 aminoacides consécutifs).

•  On savait séquencer des oligonucléotides de séquence connue.

•  On avait localisé le gène codant le facteur VIII sur la portion distale du chromosome X

Stratégie

Figure 2-47. Quelle sonde oligonucléotidique prendre ?

Du fait de la dégénérescence du code, la troisième base d'un codon est rarement unique (3 aminoacides sont codés par 6 codons avec les positions 1 et 3 dégénérées respectivement 2 et 4 fois; 1 est codé par 3 codons, la troisième position est dégénérée trois fois; 5 sont codés par quatre codons avec la position 3 dégénérée quatre fois; 5 sont codés par deux codons avec la position 3 dégénérée deux fois et seulement deux ne sont codés que par un codon: Met codon AUG et Trp codon UGG). En tenant compte des préférence dans l'usage des codons par l'organisme humain, on pouvait parier que certaines dégénérescences n'avaient pas lieu d'être prises en compte. Néanmoins il restait un grand nombre de sites qui pouvaient être occupés par deux à quatre bases. Pour ne pas risquer de passer à côté du gène un oligonucléotide très dégénéré a été synthétisé, ou plutôt, plusieurs lots portant à eux tous toutes les dégénérescences utiles ont été constitués (de l'ordre de 1 000 dégénérescences réparties en 8 lots soit 125 oligo nucléotides différents dans un même lot).

Etant donné que l'on recherchait le gène dans une banque génomique, on courait le risque que le fragment de séquence connue soit à cheval sur deux exons et devienne alors trop petit pour permettre une hybridation efficace et repérable.

Malgré ces inconnues et faute d'autres indices pour mettre au point une stratégie moins hasardeuse, l'expérience fut tentée... et réussie.

 

 

 

Figure 2-48. Stratégie de clonage du gène génomique codant le facteur VIII.

On a ainsi pu obtenir deux clones chevauchants contenant de l'ADN du gène du facteur VIII. Par une marche sur le chromosome (voir plus loin la méthode) on a pu finalement isoler presque tout le gène qui comporte 26 exons et couvre 180 kbp.

 

L'application thérapeutique s'est révélée impossible à mettre en pratique car la molécule protéique native subit des modifications post traductionnelles, que l'on n'a pas été encore capable de reproduire afin de produire du facteur VIII cloné actif.

 

Ce ne sont là que deux exemples très particuliers. Il existe d'autres méthodes (certaines d'un usage plus général) que nous verrons de façon détaillée dans les chapitres suivants. Donnons simplement le nom de ces méthodes :

•  clonage d'un gène par sauvetage d'un mutant.

•  clonage positionnel d'un gène .

•  clonage d'un gène par reconnaissance immunologique de son produit.

 


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