Université Pierre et Marie Curie

Génétique

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Plasmides

 

Découverte

pBR322

 

 

 

 

pic002.jpg

 

Figure 2-11. Carte du plasmide pBR322.
Les sites existant à un seul exemplaire sur ce plasmide sont indiqués en gras.

 

 

Structure

Le plasmide pBR 322 a été construit de toutes pièces en empruntant aux plasmides naturels certains de leurs éléments.
Son origine de réplication, de type bactérien est à contrôle relâché: en présence de chloramphénicol. Ce plasmide peut être présent à raison de 10 à 20 copies par cellule dans des conditions standard de culture. Si la culture est faite en présence de chloramphénicol qui bloque la réplication du chromosome bactérien mais pas celle du plasmide, ce dernier peut s'accumuler jusqu'à près de 1000 copies par cellule. Cette origine provient du plasmide pMB1.
Il porte également deux gènes de résistance à des antibiotiques. Le gène bla code la b lactamase qui dégrade l'ampicilline. Une bactérie portant pBR322 pourra donc pousser en présence de cet antibiotique :elle est devenue [AmpR] alors qu'une bactérie sans plasmide est tuée par l'ampicilline [AmpS]. Le gène tet confère la résistance à la tétracycline.

 

Mode d'emploi

Il faut garder présent à l'esprit qu'en biologie, une réaction quelle qu'elle soit n'a jamais un rendement de 100%, c'est parfois beaucoup moins et un des problèmes rencontrés en biologie moléculaire est de se débarrasser des résidus de ces réactions incomplètes.

pBR 322 remplit parfaitement son rôle. Les bactéries qui le reçoivent peuvent être sélectionnées sur un milieu additionné d'ampicilline.

Il possède de nombreux sites uniques de clonage : digéré par une enzyme de restriction (ex : BamHI), il est linéarisé et ne comporte qu'un seul fragment avec des extrémités cohésives. Il peut être religué avec un autre fragment d'ADN présentant des extrémités cohésives compatibles. Cette réaction à deux molécules est raisonnablement probable.

Pratiquement, dans un tube, on effectue la digestion du plasmide par BamHI. La nucléase est inactivée par la chaleur. Dans le tube on a alors des plasmides linéarisés et un reste de plasmide non coupé (rendement<10%). Dans le même tube on ajoute l'ADN à insérer et on fait agir une ligase (voir ci-dessous). On obtient un plasmide recombiné où le gène tet est interrompu par l'ADN étranger. Dans le tube coexistent deux sortes de plasmides : le plasmide natif portant bla et tet fonctionnels et les plasmides recombinés portant le gène bla fonctionnel et tet interrompu par un fragment étranger.

Figure 2-12. Les deux types de plasmides dans le tube après ligation.

Lorsque ces plasmides vont transformer des bactéries réceptrices sensibles à l'ampicilline et à la tétracycline, on va obtenir 3 types de bactéries : celles qui n'ont pas été transformées de 50 à 90%) qui sont restées sensibles à l'ampicilline ; celles qui ont reçu un plasmide natif qui sont devenues résistantes à l'ampicilline et à la tétracycline et celles qui ont reçu un plasmide recombiné qui sont devenues résistantes à l'ampicilline mais sont restées sensibles à la tétracycline. En deux étapes on va pouvoir repérer ces dernières. Toutes les bactéries sont étalées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Celles qui poussent sont répliquées sur milieu additionné d'ampicilline et de tétracycline. Celles qui poussent ont reçu un plasmide natif. Celles qui ont reçu un plasmide recombiné sont récupérées sur la matrice

 

bactérie

plasmide

résistance

croissance sur Ampicilline

croissance su Ampicilline et Tétracycline

bact. [AmpS]

aucun

aucune

-

 

bact. [AmpS]

pBR natif

à l'ampicilline et à la tétracycline

+

+

bact. [AmpS]

pBR recombiné

à l'ampicilline

+

-

Tableau 2-5.Les différents types de bactéries et la façon de les distinguer

Figure 2-13. Sélection des bactéries transformées et repérage des bactéries portant un plasmide recombiné

 

 

pUC18

 

Le plasmide pBR322 nécessite un repérage des clones portant des plasmides recombinés XE "plasmides recombinés" en deux étapes. On a mis au point une nouvelle famille de plasmides qui ne nécessitent plus qu'une étape : les pUC. Un plasmide pUC est un plasmide pBR dans lequel on a remplacé le gène de résistance à la tétracycline (qui sert à repérer les plasmides recombinés) par un gène bactérien lacZ qui code la (galactosidase (revoir l'opéron lactose). Cette enzyme a pour propriété d'hydrolyser le lactose en glucose et galactose. Un produit non toxique pour la cellule bactérienne est également substrat de la (galactosidase : le Xgal.

 

Les plasmides pUC ont également un site de clonage situé dans le début du gène lacZ (en réalité toute une série de tels sites dans la zone mcs pour multiple cloning sites).

Donc un plasmide pUC natif apportera le gène lacZ fonctionnel et une bactérie qui le portera, cultivée sur milieu additionné de Xgal deviendra bleue alors qu'un pUC recombiné aura perdu l'intégralité de son gène lacZ et la bactérie qui le portera donnera un clone qui restera blanc. Il faut évidemment que la souche bactérienne utilisée ait perdu l'activité de sa (galactosidase, on utilise des souches délétées pour l'ensemble de l'opéron lac.

bactérie

plasmide

résistance

état du gène lacZ

croissance sur Ampicilline

couleur du clone sur Xgal

bact. [AmpS]

aucun

aucune

délété

-

pas de clone

bact. [AmpS]

pUC natif

à l'ampicilline

fonctionnel

+

bleu

bact. [AmpS]

pUC recombiné

à l'ampicilline

interrompu

+

blanc

Tableau 2-6.Les différents types de bactéries et la façon de les distinguer.

Figure 2-14. Sélection des bactéries transformées portant un plasmide pUC recombiné.

La capacité maximum de ces plasmide est de 10kbp d'ADN étranger.

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