Les projets de séquençage de génomes complets ont été commencés vers 1987. A cette époque on savait déjà extraire, visualiser et séquencer l'ADN de façon enzymatique (méthode de Sanger mise au point en 1975). On maîtrisait des techniques de clonage de fragments d'ADN. Une stratégie générale avait donc été définie en fonction de ces outils

Figure 2-1 Stratégie de séquençage pour un génome complet

Qu'appelle-t-on un clone ? La reproduction clonale est la reproduction à l'identique sans intervention de deux parents. C'est le mode de reproduction des bactéries. Une cellule en donne deux en se clivant.

Figure 2-2. Un clone : toutes les cellules de la 6^ème génération sont identiques à la cellule mère du clone.

Cloner un génome, c'est le mettre dans une cellule qui le reproduit à l'identique. Une cellule a déjà son propre ADN qui lui fournit toutes les informations nécessaires à sa vie. Elle ne peut pas prendre en charge une grande quantité d'ADN surnuméraire. Au lieu de chercher à mettre tout l'ADN génomique d'un organisme dans une seule cellule, on va fragmenter ce génome et la reproduction conforme de chaque fragment obtenu au hasard sera confié à une cellule. Dans ces conditions ce n'est pas un clone cellulaire qui contiendra tout le génome étudié mais une collection de clones. Cet ensemble disparate constitue une banque génomique.

Comment un morceau d'ADN étranger peut-il se maintenir dans une cellule hôte ? S'il entre tel quel dans une cellule avec des extrémités libres (sans protection du type des structures télomériques, par exemple) il va être immédiatement dégradé par les nucléases de la cellule hôte. On utilise des structures spécialisées, les vecteurs (plasmides ou autres) qui en intégrant le fragment d'ADN dans un cercle d'ADN le protège des nucléases intracellulaires. De plus ces vecteurs possèdent une origine autonome de réplication qui va assurer la multiplication du vecteur et du fragment d'ADN étranger qu'il porte.

Préparation de l'ADN à cloner

L'extraction d'ADN d'un organisme est un protocole classique dans lequel on utilise la propriété de l'ADN d'être soluble dans l'eau contrairement aux protéines liposolubles. Dans la fraction acqueuse on a les acides nucléiques ADN mais aussi ARN. Ces derniers sont extrêment fragiles et sans doute une grande partie a-t-elle déjà été dégradée par l'ARNase descellules de l'organisme dont on prépare l'ADN. Cependant si l'on souhaite éliminer tout l'ARN on peut faire agir in vitro(dans le tube par opposition à in vivo :dans la cellule) de l'ARNase. A-t-on récupéré l'ADN ,sous quelle forme et en quelle quantité ? On peut visualiser le produit de l'extraction dans un gel d'agarose.

Visualisation de l'ADN

L'ADN est une molécule qui se déplace dans un champs électrique (du pôle - vers le pôle +).Quelque soit sa taille sa charge ne varie pratiquement pas. On va donc emprisonner l'ADN dans un réseau de "filets" (ou tamis moléculaire) et le soumettre à un champ électrique. Le tamis moléculaire est constitué par un gel (Ce gel est constitué d'une solution d'agarose dans un mélange aqueux chaud qui prend en masse en refroidissant. On peut remplacer l'agarose par de l'acrylamide qui polymérise spontanément à la température ambiante. La différence principale réside dans la taille de la maille du tamis moléculaire, plus fine avec de l'acrylamide. un gel d'agarose permet de séparer des fragments dont la taille diffère par une centaine de bp au moins, alors que le polyacrylamine permet une résolution à la base près.) liquide qui se solidifie en polymérisant. L'ADN va se déplacer, les morceaux les plus petits se faufileront plus facilement entre les mailles alors que les fragments plus gros seront ralentis en fonction de leur taille (fonction complexe que l'on n'a pas caractérisée mathématiquement ). Pour voir les fragments d'ADN ainsi triés par tailles on utilise les propriétés de cette molécule en double hélice. Elle est capable d'absorber l'énergie de rayons ultraviolets et de permettre l'intercalation entre les plateaux de bases appariées des moléculesde bromure d'ethidium (BET qui peut ainsi induire des mutations). L'énergie des rayons U.V.absorbée par l'ADN est transmise au B.E.T. qui l'utilise pour émettre une lumière orangée.

Dans le gel, là où il y a de l'ADN, du B.E.T. peut se fixer ,des U.V. lui transmettent leur énergie par l'intermédiaire de l'ADN et cet endroit, caractéristique de la taille du fragment de l'ADN apparaît comme une ligne colorée plus ou moins épaisse en fonction de la quantité d'ADN présente.

 

A

Figure 2-3.A: schéma dessus et profil du dispositif utilisé pour faire une électrophorèse en gel d'agarose.
B photographie sous UV du gel après migration.