Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Sélection de mutants
Crible et repérage
Répartition
Mécanisme
Efficacité
Inactivation dun gène
Corrélation maladie héréditaire et gène muté
Analyse fonctionnelle
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Efficacité

 

Pour mesurer l'importance de la mutagenèse sur la levure il faut examiner les résultats d'une expérience dans laquelle on a sélectionné des mutants parmi des cellules d'une souche sauvage.

Dans cet exemple la sélection portera sur des mutants résistants à la canavanine, analogue de l'arginine. Cet analogue est toxique et entraîne la mort des cellules sauvages.

Figure 4- 14. L'arginine et son analogue toxique la canavanine.

Une culture de cellules sauvages [CanS] est partagée en deux fractions de même volume. L'une est exposée aux UV, puis étalée sur milieu contenant de la canavanine. Pour être sûr de voir des colonies séparées on va étaler plusieurs dilutions de la suspension cellulaire (Une suspension est diluée d’un facteur 100 (dilution au 1/100) lorsque l’on prend 1 volume de la suspension et qu’on y ajoute 99 volumes d’eau, le volume final est donc de 100 volumes et il y a autant de cellules dans un volume initial que dans 100 volumes finalement, autrement dit 1ml de la dilution contientn10 fois moins de cellules qu’un ml de la suspension initiale (ViCi=VfCf, V=volume, C=concentration, i pour initial, f pour final). Afin de mettre en évidence l'effet des UV on va dénombrer la totalité des cellules en étalant également les cellules sur milieu minimum. Avec l'autre fraction qui n'a pas subi les UV les mêmes étalements seront faits. Les résultats sont résumés dans le tableau 4-2.

Les constatations suivantes peuvent être faites :

• même sans mutagenèse il apparaît spontanément des mutants résistants
• la fréquence de ces mutants après mutagenèse est considérablement augmentée: on en trouve encore à une dilution 100 fois plus grande.
• sans UV on compte toutes les cellules qu’elles soient [CanS] ou [CanR], après UV et dans les mêles conditions il y a de l’ordre de 100 fois moins de cellules.
Ceci permet d’exprimer les résultats avec les valeurs suivantes
nombre de cellules vivantes (puisqu’elles ont donné naissance à un clone) avant irradiation

100cellules x 106 =108 cellules

nombre de cellules vivantes après irradiation

100cellules x 104 =106 cellules

Les UV tuent une fraction des cellules. % de survie après irradiation

106/108=0,01 soit 1%

Le grisé foncé indique une croissance confluente dans les boites, le blanc aucun clone.

Tableau 4- 1. Résultats d'une expérience de mutagenèse.

Connaissant le nombre total de cellules et le nombre de cellules [CanR], on peut en calculer la fréquence

sans irradiation 4 / 108 = 4 x10-8
après irradiation 100 / 106 = 10-4

La fréquence des mutants est très augmentée par les UV (rigoureusement, pour voir l'effet des UV, il aurait fallu ôter aux 100 colonies observées les 4 colonies dues à des mutation spontanées. La différence ne dépasse pas l'erreur statistique d'échantillonnage 100 et 96 ne sont pas statistiquement différents).

Par mutagenèse in vivo on tente de modifier l'ADN localement à l'aide d'agents chimiques ou physiques. Les modifications sont rares et ont lieu au hasard. C'est le crible choisi qui détermine, parmi tous les mutants que l'on a induit ceux que l'on va récupérer.

 

 

 

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