Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Sélection de mutants
Inactivation d’un gène
Knock out d’un gène de levure
Mutation dirigée
Intégration du gène muté dans l’organisme
Corrélation maladie héréditaire et gène muté
Analyse fonctionnelle
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Intégration du gène muté dans l’organisme

 

 

Avoir construit le gène est une chose. L'introduire dans l'organisme pour étudier le résultat en est une autre.

Cette introduction se fait selon certains principes simples que nous avons déjà vu. L'ADN est capable de se dénaturer et de se renaturer. La renaturation exige la complémentarité des bases, elle doit donc pouvoir se faire entre régions homologues du génome. Normalement l'organisme n'a que peu de raisons de remanier son ADN. Par contre si des cassures (mono ou double brin) se produisent accidentellement cela va favoriser ce type d'événements que l'on regroupe sous le nom de recombinaison homologue (Il peut même, dans certains organismes et dans des conditions particulières y avoir de la recombinaison non homologue, mais elle est beaucoup plus rare.) (Figure 4-13).

Dans le cas d'un gène inactivé par interruption de sa phase de lecture par l'insertion d'un autre gène (LEU2+), il faut prendre une souche qui contient un génome complet (donc le gène X) sauf le gène leu2 pour lequel elle est délétée. Son phénotype est [leu-].

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Figure 4- 17. Principe de la recombinaison homologue.

On la transforme par un fragment linéaire d'ADN qui ne comporte que le gène X avec au milieu le gène LEU2 fonctionnel. La seule région homologue entre les deux ADN est le gène X. C'est donc là qu'ils vont s'apparier. Si l'on sélectionne les cellules qui sont devenues [leu+], on a un crible puissant pour récupérer des cellules même dues à des événements assez rares. Pour pouvoir obtenir ces cellules il faut évidemment qu'elles soient viables.

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Figure 4- 18. Sélection d'une souche de levure dont le gène X a été inactivé.

Dans le cas d'un gène qui a subi une mutation dirigée en un point la méthode précédente n'est plus utilisable.

Exemple de l'étude du gène de la transcétolase de levure.

C’est un gène pour lequel on n’a pas de mutants.
Dans une première étape il a été interrompu par le gène fonctionnel HIS3 et comme décrit ci-dessus, une souche a été construite qui porte ce gène interrompu. La souche initiale était délétée pour les gènes his3 et leu2 donc de phénotype [His-, Leu-]. La souche qui a intégré le gène interrompu ne fabrique plus de transcétolase et elle est [His+, Leu-].
Dans une seconde étape , après une étude biochimique de la forme sauvage de l’enzyme (la seule connue, puisqu’on n’a pas isolé de mutants qui en synthétisent une forme modifiée) on pense que les acides aminés autour de la position 418 pourraient avoir une importance particulière. Avec le mode opératoire de la figure 4-12 on a construit un gène qui code pour une transcétolase où à la position 418 Arg remplace Glu. Ce gène est intégré dans un plasmide spécifique de la levure qui possède comme marqueur de sélection la forme fonctionnelle du gène LEU2.
On peut donc transformer des cellules de levure avec le gène d’origine interrompu par le plasmide qui porte le gène muté. De telles cellules seront [His+, Leu+].
Dans ce cas, le gène modifié ponctuellement n’est pas intégré à sa place normale dans le génome. Il est néanmoins dans un contexte cellulaire normal qui assure une synthèse et d’éventuelles modifications post traductionnelles physiologiquement correctes. On peut ainsi étudier l’impact de la mutation sur la protéine.

 

Chaque organisme présente des particularités qui sont exploitées en biologie moléculaire : il existe des méthodes plus particulièrement adaptées lorsqu'on travaille sur la souris comme organisme modèle ou sur la drosophile. Le but de ce cours n'est pas de passer en revue toutes ces méthodes mais de faire comprendre le but et les grands principes de la génétique, moléculaire ou mendélienne..

 

 

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