Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Sélection de mutants
Inactivation d’un gène
Knock out d’un gène de levure
Mutation dirigée
Intégration du gène muté dans l’organisme
Corrélation maladie héréditaire et gène muté
Analyse fonctionnelle
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Mutation dirigée

 

Le gène que l'on veut étudier est cloné dans un vecteur. On a déjà des indications sur sa fonction et on désire en acquérir de nouvelles sur une région particulière du gène.

On choisit le nucléotide que l'on veut changer, et on prépare un oligonucléotide qui contient la séquence environnante du gène autour de ce nucléotide. D'un autre coté on prépare le plasmide recombiné avec le gène et on le dénature par la chaleur. Les deux sont séparés par électrophorèse. On met en présence l'oligonucléotide et le brin plasmidique qui contient la séquence complémentaire correspondante. On renature les deux ADN et on incube en présence d'ADN polymérase et de ligase. L'oligonucléotide va être allongé en recopiant le brin complet. Le plasmide obtenu est double brin avec un mésappariement à l'endroit de la mutation. On transforme une culture bactérienne qui va multiplier ce plasmide. Deux types seront produits en quantité théoriquement égale par duplication de chaque brin. On obtiendra donc un plasmide contenant le gène sauvage et un plasmide contenant le gène muté (Figure 4-16)

Pour distinguer ces deux types on dispose de plusieurs moyens

• la mutation a pu modifier un site de restriction ce qui permet de discriminer les 2 types
• le séquençage de la région que l’on voulait muter donne dans tous les cas la réponse
• certaines protéines sont exprimées par les bactéries (le plasmide doit être bien choisi), dans ce cas on peut repérer la forme du gène par l’activité de la protéine qu’il code.

pic008.jpg

Figure 4- 16. Mutagenèse dirigée en un site précis.

 

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