Université Pierre et Marie Curie

Génétique

Introduction
Génes et génomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Sélection de mutants
Crible et repérage
Répartition
Mécanisme
Efficacité
Inactivation d’un gène
Corrélation maladie héréditaire et gène muté
Analyse fonctionnelle
Cartographie
Biodiversite, évolution
Applications
Glossaire
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Sélection de mutants

 

 

La levure (Saccharomyces cerevisiae) est un organisme modèle qui présente de nombreux avantages. On peut la cultiver presque aussi facilement qu'un microorganisme sur un milieu minéral qui contient une source d'énergie et de carbone (un sucre). Les cellules ont tout l'équipement enzymatique pour synthétiser à partir de là leurs éléments constitutifs. Elles sont prototrophes (par opposition à auxotrophe : qui exige quelque chose de plus). Leur temps de génération est relativement court, 3h à 28°C,. Les cellules existent en deux versions haploïdes et diploïdes facilement observables et cultivables, le temps de génération est le même pour les deux phases. Les quatre produits d'une même méiose restent réunis dans une asque et peuvent être étudiés. Par contre cet organisme n'est pas idéal dès que l'on veut étudier des problèmes complexes de différentiation cellulaire.

La recherche de mutants se fait sur le type de cellules le plus simple : les cellules haploïdes (sauf exception). Dès qu'il y a un changement dans l'ADN, s'il entraîne une modification du phénotype celle-ci est repérable. Quelles modifications va-t-on repérer ? Chaque matériau (acide aminé ,base azotée, etc.) constituant des protéines et des acides nucléiques est l'aboutissement d'une chaîne biosynthétique (cf. chapitre 3). Si un gène codant une enzyme de cette chaîne est inactivé par mutation la cellule qui était prototrophe va devenir auxotrophe. Cette différence est repérable par comparaison de la croissance des même cellules sur deux milieux l'un qui n'apporte que le sucre et les éléments minéraux et l'autre qui en plus apporte un acide aminé.

 

Figure 4- 1. Réplique velours, A : une boite où des cellules ont déjà formé des clones est appliquée sur un cylindre recouvert d'un velours, pis sur le même velours qui a retenu dans ses poils des cellules de chaque clone, on applique plusieurs boites sur lesquelles le velours dépose quelques unes de ces cellules . B : la matrice a donné deux boites où les colonies sont disposées de la même façon, on peut repérer facilement celles qui sont auxotrophes pour l'arginine.

En général on fait croître les cellules avec du glucose comme source de carbone. D'autres sucres, galactose, maltose, lactose etc. peuvent être utilisés. Les voies dégradatives sont spécifiques de chacun des sucres. Alors que la souche sauvage est apte à se développer sur tous ces sucres, des cellules ayant une mutation dans un gène qui code pour une des enzymes de ces voies seront incapables d'utiliser le sucre correspondant. Elles seront devenues non utilisatrices de galactose [gal non u.]. Le repérage de tels clones se fera comme précédemment avec deux milieux, l'un contenant du glucose comme seule source de carbone et l'autre où ce sucre sera remplacé par du galactose

Figure 4- 2. Repérage de clones [galnon u].

Pour pouvoir étudier un mutant il faut qu'il puisse se multiplier au moins dans certaines conditions, même si dans d'autres il n'est pas viable. De tels mutants sont des mutants létaux conditionnels : l'étude du cycle cellulaire de la levure a nécessité l'isolement de mutants qui se multiplient à 23°C mais qui en sont incapables à 37°C (température à laquelle la souche sauvage est encore capable de donner des clones). Le phénotype de tels mutants est thermosensible, [TS].

La croissance de la levure est inhibée par certains produits tels que la canavanine, le chloramphénicol, l'éthionine. Ce sont souvent des analogues d'acides aminés ou de bases azotées que le métabolisme cellulaire incorpore par erreur dans les protéines ou acides nucléiques , ce qui entraîne l'inactivation de ces protéines et la mort de la cellule. On peut repérer des colonies qui sur un milieu contenant un de ces inhibiteurs est encore capable de pousser. On a alors un clone résistant. Contrairement aux deux cas précédents, ici il est inutile de procéder par réplique puisque ce que l'on cherche est un type de colonies qui pousse alors que le sauvage ne pousse pas. On dispose d'un crible positif. Ce type de mutants est beaucoup plus facile à sélectionner.

 

  Crible et repérage
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