La levure (Saccharomyces
cerevisiae) est un organisme modèle qui présente de
nombreux avantages. On peut la cultiver presque aussi facilement
qu'un microorganisme sur un milieu minéral qui contient
une source d'énergie et de carbone (un sucre). Les cellules
ont tout l'équipement enzymatique pour synthétiser à partir
de là leurs éléments constitutifs. Elles sont prototrophes
(par opposition à auxotrophe : qui exige quelque chose de
plus). Leur temps de génération est relativement court,
3h à 28°C,. Les cellules existent en deux versions haploïdes
et diploïdes facilement observables et cultivables, le temps
de génération est le même pour les deux phases. Les quatre
produits d'une même méiose restent réunis dans une asque
et peuvent être étudiés. Par contre cet organisme n'est
pas idéal dès que l'on veut étudier des problèmes complexes
de différentiation cellulaire.
La recherche de mutants
se fait sur le type de cellules le plus simple : les cellules
haploïdes (sauf exception). Dès qu'il y a un changement
dans l'ADN, s'il entraîne une modification du phénotype
celle-ci est repérable. Quelles modifications va-t-on repérer
? Chaque matériau (acide aminé ,base azotée, etc.) constituant
des protéines et des acides nucléiques est l'aboutissement
d'une chaîne biosynthétique (cf. chapitre 3). Si un gène
codant une enzyme de cette chaîne est inactivé par mutation
la cellule qui était prototrophe va devenir auxotrophe.
Cette différence est repérable par comparaison de la croissance
des même cellules sur deux milieux l'un qui n'apporte que
le sucre et les éléments minéraux et l'autre qui en plus
apporte un acide aminé.
Figure
4- 1. Réplique velours, A : une boite où des cellules
ont déjà formé des clones est appliquée sur un cylindre
recouvert d'un velours, pis sur le même velours qui a retenu
dans ses poils des cellules de chaque clone, on applique
plusieurs boites sur lesquelles le velours dépose quelques
unes de ces cellules . B : la matrice a donné deux boites
où les colonies sont disposées de la même façon, on peut
repérer facilement celles qui sont auxotrophes pour l'arginine.
En général on fait croître
les cellules avec du glucose comme source de carbone. D'autres
sucres, galactose, maltose, lactose etc. peuvent être utilisés.
Les voies dégradatives sont spécifiques de chacun des sucres.
Alors que la souche sauvage est apte à se développer sur
tous ces sucres, des cellules ayant une mutation dans un
gène qui code pour une des enzymes de ces voies seront incapables
d'utiliser le sucre correspondant. Elles seront devenues
non utilisatrices de galactose [gal non u.].
Le repérage de tels clones se fera comme précédemment avec
deux milieux, l'un contenant du glucose comme seule source
de carbone et l'autre où ce sucre sera remplacé par du galactose
Figure 4- 2. Repérage
de clones [galnon u].
Pour pouvoir étudier un
mutant il faut qu'il puisse se multiplier au moins dans
certaines conditions, même si dans d'autres il n'est pas
viable. De tels mutants sont des mutants létaux conditionnels
: l'étude du cycle cellulaire de la levure a nécessité l'isolement
de mutants qui se multiplient à 23°C mais qui en sont incapables
à 37°C (température à laquelle la souche sauvage est encore
capable de donner des clones). Le phénotype de tels mutants
est thermosensible, [TS].
La croissance de la levure
est inhibée par certains produits tels que la canavanine,
le chloramphénicol, l'éthionine. Ce sont souvent des analogues
d'acides aminés ou de bases azotées que le métabolisme cellulaire
incorpore par erreur dans les protéines ou acides nucléiques
, ce qui entraîne l'inactivation de ces protéines et la
mort de la cellule. On peut repérer des colonies qui sur
un milieu contenant un de ces inhibiteurs est encore capable
de pousser. On a alors un clone résistant. Contrairement
aux deux cas précédents, ici il est inutile de procéder
par réplique puisque ce que l'on cherche est un type de
colonies qui pousse alors que le sauvage ne pousse pas.
On dispose d'un crible positif. Ce type de mutants est beaucoup
plus facile à sélectionner.
