Génétique

Microsatellites

Définition

Un second type de repère est constitué par de l'ADN répété : un microsatellite est la répétition en tandem (toujours dans le même sens , par opposition à répétitions inversées répétées)un certain nombre (variable) de fois d'un motif court (de 1 à 4 nucléotides, le plus souvent). Pour que ce marqueur puisse être un repère non ambigu, il doit être entouré à droite et à gauche de séquences uniques.

Figure 3-52. Détail d'un microsatellite.

Selon les individus un microsatellite peut comporter un nombre de répétitions qui est différent.

Mise en évidence

Pour isoler des microsatellites, on va de nouveau partir d'une banque génomique humaine que l'on hybride avec de l'ADN humain total (comme dans le cas des RFLP) mais cette fois les clones intéressants sont ceux qui présentent une affinité décelable pour l'ADN génomique (contrairement au cas précédent). Ces clones contiennent de l'ADN qui s'hybride facilement donc fréquent dans le génome. Il y a donc de fortes chances que ce soit de l'ADN répété. Il faut ensuite les reprendre un à un pour mettre en évidence de part et d'autre de la région répétée des portions de séquences uniques dans le génome. Encadrant le motif répété, et situé dans les parties uniques, on détermine deux amorces de 20 à 40 nucléotides (séquences simple brin) qui vont servir lors d'une réaction d'amplification en chaîne (Polymerase Chain Reaction) pour synthétiser un grand nombre de copies du motif. L'ADN produit par cette réaction sera analysé par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide dénaturant afin d'en déterminer la longueur. Souvent cette longueur est variable : le microsatellite présente plusieurs formes alléliques.

La réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction)

c'est un outil extrêment utilisé en biologie moléculaire. Il est temps d'en donner les grandes lignes. On utilise une polymérase pour recopier de l'ADN dénaturé. Rien de nouveau, sauf que l'ADN ainsi synthétisé va à son tour servir de matrice pour de nouveaux cycles de synthèse. Or pour le dnaturer il faut le chauffer, et le chauffage dénature et inactive les protéines ! Il existe des organismes capables de vivre à des températires extrêmes (aussi bien hautes que basses) et en 1989, Saïki a utilisé une polymérase extraite d'une bactérie thermophile, polymérase qui résiste à des températures de l'ordre de 95°C. Les schémas suivants donnent les premières étapes de la PCR. Notez bien la taille des molécules néosynthétisées à chaque cycle et voyez celles qui s'accumulent le plus abondamment, ce seront les seules visibles.

Cycle de PCR	1	2	3	4	5	6	7
molécules d'ADN copiées	2	4	8	16	32	64	128
copies du usat (()	0	0	2	8	22	52	114
copies de taille différente	2	4	6	8	10	12	14

Tableau 3-3. Evolution du nb de copies en f des cycles de PCR.

Quelques sites qui présen,tent une animation PCR :

en anglais

en français

Un microsatellite est donc complètement défini par

le motif répété qui le compose
les amorces uniques qui l'encadrent et servent à l'identifier et à l'amplifier.

Un marqueur microsatellite, avec un organisme qui ne porte qu'un lot de chromosomes (ou organisme haploïde) ne doit présenter qu'une bande amplifiée. Un individu diploïde ne présentant qu'une bande amplifiée doit porter le même nombre de répétitions sur ses deux chromosomes homologues. Il est dit homozygote. S'il présente deux bandes de tailles différentes alors les deux chromosomes homologues portent un nombre de répétitions différentes, la personne est dite hétérozygote. Dans la dernière figure ci-dessus seul 3 est homozygote pour la forme 4 répétitions. tous les autres sont des hétérozygotes.

n° du sujet	nb de répétitions d'un allèle	nb de répétitions de l'autre allèle	haplotype*	génotype*
1	4	17	4,17	4/17
2	10	23	10,23	10/23
3	4	4	4	4/4
4	13	16	13,16	13/16
5	4	11	4,11	4/11
6	3	14	3,14	3/14

L'haplotype décrit seulement les différentes formes observables chez un individu, alors que le génotype indique, l'une sous l'autre (puisqu'elles sont homologues), les deux formes présentes.

Tableau 3-4.Interprétation du gel d'analyse de PCR.

Détection

La détection d'un microsatellite connu comporte les étapes suivantes :

extraction deb l'ADN génomique
réaction de PCR avec cet ADN et le couple d'amorces correspondant au microsatellite exploré
électrophorèse sur gel de polyacrylamide (haute résolution).

Ce protocole est moins délicat et plus rapide que celui de la détection des RFLP. C'est une des raisons qui ont conduit à l'abandon, lorsque cela est possible, des RFLP au profit des microsatellites.

Fréquence

Dans ce qui précède on a pu voir des exemples de microsatellites qui présentent de nombreuses formes alléliques distinctes. Dans ce cas la fréquence des hétérozygotes pour ce type de marqueur pourra être beaucoup plus élevée et donc d'une utilité plus générale. C'est une raison de plus de préférer les microsatellites quand on a le choix.

Les microsatellites sont dans l'ensemble répartis uniformément dans l'ensemble du génome humain à raison d'un tous les 10kbp, en moyenne. Néanmoins, il peut y avoir des zones ou plus rares ils ne sont alors pas pratique à utiliser.

Le tableau 3-5 présente plusieurs marqueurs étudiés dans une population irlandaise. 3 types de marqueurs sont présents : des RFLP simples (qui ne donnent jamais plus que 50% d'hétérozygotes) des RFLP qui combinent plusieurs sites voisins et des microsatellites . On peut remarquer que pour l'ensemble de ces deux dernier la fréquence d'hétérozygotes est en général très supérieure à 50%.

Si l'on appelle p_a, p_b, p_c, ...p_n les fréquences respectives des différents allèles pour un marqueur donné la fréquence attendue d'hétérozygotes est égale à 1 diminué de la fréquence des homozygotes (p_a²+p_b²+p_c²+...+p_n² = ((p_n²)

Symbole du locus	nom du site	% hétérozygotes attendus	Exp Het
APOB	EcoRI		0.23
APOB	XbaI		0.50
COMT	BglI		0.20
COMT	HindIII		0.48
D10S94	TaqI		0.19
APOB	2-site haplotype (XbaI, EcoRI)		0.61
COMT	3-site haplotype (HindIII, NlaIII, BglI)		0.75
CYP2E	3-site haplotype (PstI, RsaI, MspI)		0.10
PAH	4-site haplotype (BglII, PvuII A, MspI, XmnI)		0.80
DRD2	5-site haplotype (TaqI B, TaqI D, (GT) STRP, HincII, TaqI A)		0.82
Class I ADH	6-site haplotype		0.74
D2S123	D2S123 dinucleotide STRP		0.71
DRD2	Intron 2 (GT)n dinucleotide STRP		0.67
HOXB6	(CA)n STRP		0.64
SLC6A3	2-site haplotype (3' VNTR, G2319A MspI)		0.59
COMT	4-site haplotype (HindIII, (TAAA) repeat, NlaIII, BglI)		0.85

Tableau 3-5. Fréquence attendue des hétérozygotes pour différents marqueurs dans une population irlandaise.

Figure 3-13. Carte du chromosome 7 humain montrant la répartition des marqueurs microsatellites.