Pour ces marqueurs il faut distinguer deux étapes.

Tout d'abord l'identification de certains points qui présentent du polymorphisme (mise en évidence), à partir d'une banque d'ADN.

Ensuite, pour chaque marqueur la révélation de son état chez un individu donné (détection) qui doit être la plus simple possible et présenter des qualités indiscutables de fiabilité et de reproductibilité (travail de routine des laboratoires d'analyses).

Les deux étapes ont des objectifs différents et mettent en jeu des techniques également différentes.

RFLP

Les fragments de restriction obtenus à partir d'un bout d'ADN dépendent de l'enzyme utilisée pour les générer ainsi que de la séquence de ce bout d'ADN puisque l'ER a une spécificité de coupure.

Une mutation pourra, en modifiant la séquence primaire de l'ADN entraîner une modification de sa carte de restriction (un site qui disparaît ou au contraire qui apparaît).

Il est déraisonnable de chercher à caractériser un génome complet par les fragments de restriction obtenus puisque même pour un génome relativement petit (bactérie de l'ordre de 10⁶bp) une ER ayant un site de 6bp (un site toutes les (1/4)⁶ bp) donnera de l'ordre de 250 fragments (10⁶/4⁶) qui, par électrophorèse en gel d'agarose ne seront pas séparés et donneront une traînée.

Pour être un repère fiable, un RFLP doit être identifiable sans aucune ambiguïté, il ne peut donc se trouver que dans une région non répétée du génome.

Définition

Pour définir un RFLP on a besoin

• d'une sonde d'ADN représenté une seule fois dans le génome (de quelques centaines de bp) et qui sera marquée (par nick translation au 32P)
• d'une enzyme de restriction qui possède un site proche de la région unique d'ADN qui hybride avec la sonde

Figure 3-5.Ce RFLP est défini par l'enzyme PstI qui présente un polymorphisme de coupure près de la sonde. Si le site polymorphe existe, la sonde hybridera avec un fragment de 3kbp, si le site est absent, la taille du fragment hybridant avec la sonde sera de4kbp.

 

Mise en évidence

Pour mettre en évidence un RFLP on procède en deux étapes:

1. recherche dans une banque génomique de clones qui ne contiennent que de l'ADN unique (exclusion de tous ceux qui portent de l'ADN répété).
2. recherche d'une endonucléase de restriction qui sur la région contenant l'ADN unique précédemment isolé produit un polymorphisme de la taille des fragments générés.( Ce polymorphisme doit être suffisamment fréquent dans la population pour être utile)

On commence donc par constituer une banque d'ADN génomique dans un vecteur classique (ici les vecteurs qui ont une très grande capacité ne sont d'aucune utilité car leur probabilité de n'avoir que de l'ADN non répétitif est en raison inverse de leur capacité). On transfère les clones de cette banque sur une membrane de nylon afin de pouvoir les hybrider. Puisque l'on veut distinguer les clones qui contiennent de l'ADN répétitif des autres on a pensé que les premiers sont ceux qui vont retenir le plus facilement de l'ADN génomique total, qui est lui aussi riche en ADN répété. On marque par nick-translation de l'ADN génomique au 32P (voir Ch2). Cet ADN sert à hybrider l'ADN des clones fixé à la membrane de nylon. Après lavage on fait une autoradiographie. Les clones marqués sont ceux que l'on va exclure. L'ADN inséré dans chacun des autres vecteurs est ensuite sous cloné, souvent dans un plasmide, plus simple à manipuler. On dispose alors d'une collection d'inserts d'ADN unique qui vont servir de sonde pour la seconde étape.

Il faut maintenant reconnaître si une endonucléase génère des fragments de taille différentes sur différents exemplaires de la région chromosomique contenant l'insert repéré à l'étape précédente.

On prélève des leucocytes sur une vingtaine d'individus sans liens de parenté. Pour chaque échantillon on extrait l'ADN génomique. Chacun des vingt ADN va être soumis a diverses digestions par une seule endonucléase à chaque fois (de l'ordre de 30 enzymes sont essayées en moyenne). Le résultat de ces digestions complètes est la fragmentation en un grand nombre de morceaux de tailles variées puisque tout le génome est représenté. Le produit de chaque digestion est déposé sur un gel d'agarose et subit une électrophorèse qui a pour effet de trier les fragments par ordre décroissant de taille.

La sonde d'ADN unique marquée au ³²Pmise en évidence à l'étape précédente va servir à reconnaître dans tout le génome le ou les morceaux qui contiennent cette séquence. On transfère l'ADN du gel d'agarose sur membrane de nylon (technique du Southern blot).On hybride la membrane et l'ADN qu'elle porte avec la sonde marquée radio activement; et on en fait une autoradiographie. Les résultats observés peuvent être de deux types.

Soit, pour une enzyme donnée les 20 échantillons donnent la ou les mêmes bandes, ce qui signifie que, au voisinage de la sonde les 20 génomes sont découpés par l'endonucléase de la même façon: absence de polymorphisme.

Soit pour une autre enzyme parmi les 20 échantillons certaine bandes ont des tailles différentes selon les individus. Dans ce dernier cas, il y a bien un polymorphisme de la longueur des fragments de restriction qui permet de distinguer deux zones homologues puisque l'une porte un site de coupure là ou l'autre n'en a pas.

Figure 3-6. Mise en évidence d'un site RFLP révélé par la sonde X et TaqI

Détection

Figure 3-7. Etapes de la révélation du RFPL porté par un ADN.

La technique utilisée qui comporte un southern blot, une hybridation et une autoradiographie est longue (plusieurs jours) et délicate. C'est une des raisons qui font que l'on préfère aujourd'hui les microsatellites comme repères.

Figure 3-8.Répartition de quelques marqueurs RFLP sur le chromosome humain 22 (un des plus petit). La nomenclature de ces marqueur comporte le numéro du chromosome l'indication que le locus est unique (S) et son n°d'identification

Fréquence

Pour un site de restriction donné il n'y a que 2 possibilités être ou ne pas être. Deux formes mutuellement exclusives, on dit deux formes alléliques, elles occupent le même endroit (ou locus) sur l'ADN humain. Ces deux formes peuvent avoir la même fréquence soit 50% chacune ou l'une est plus fréquente que l'autre (tous les cas de figure sont possibles). Vous verrez par la suite que ces marqueurs sont particulièrement intéressants pour distinguer les deux chromosomes d'un individu (diploïde). On ne pourra faire une telle distinction que si les 2 chromosomes sont différents. Quelle est donc la probabilité qu'un individu porte deux formes différentes si l'une a la fréquence p et l'autre la fréquence (1-p) puisque ce sont les deux seules possibilités

Figure 3-9. Fréquence d'un hétérozygote suivant les fréquences des 2 allèles.

Figure 3-10. Variation de la fréquence des hétérozygotes en fonction des fréquences alléliques.

On voit que plus chacun des deux allèles aura une fréquence proche de 50% plus haute sera la fréquence des hétérozygotes. Donc les RFLP les plus utiles seront ceux pour lesquels les deux allèles présenteront les fréquences les plus proches.

Il arrive que plusieurs sites polymorphes soient très proches , permettant de générer plus de deux fragments différents

Figure 3-11. Haplotypes multiples obtenus avec 2 Rflp associés à une seule sonde Y.

On appelle haplotype l'une des formes possibles pour le génotype d'un complexe de gènes ( gènes proches les uns des autres). Ce terme est appliqué aux complexes de gènes plutôt que le terme allèle, qui fait référence à une des formes possibles pour un gène isolé.