Définition

Les SNP(Single Nucleotide Polymorphism) constituent la forme la plus abondante de variations génétiques dans le génome humain. Ils représentent plus de 90% de toutes les différences entre individus. C'est un type de polymorphisme de l'ADN dans lequel deux chromosomes diffèrent sur un segment donné par une seule paire de bases.

Dans deux génomes humains tirés au hasard, 99,9% de la séquence d'ADN est identique. Les 0,1% restants contiennent des variations de séquence dont le type le plus commun est le polymorphisme pour un nucléotide (SNP). Les SNP sont stables, très abondants et distribués uniformément dans tout le génome. Ces variations sont associées à de la diversité entre populations ou individus, une différence de sensibilité à des maladies et la réponse individuelle aux médicaments.

Mise en évidence

De nombreux SNP ont été mis en évidence lors de l'étude de sujets sains et malades portant des allèles différents d'un gène donné.

Il existe aujourd'hui de nombreuses méthodes pour mettre en évidence des différences d'un nucléotide. Une des plus performante actuellement et qui paraît offrir de grandes espérances est l'usage des puces à ADN

Puces à ADN

La technologie des puces à ADN s'inspire de la technique des analyses de gels en Southern blot par hybridation. Ici encore l'ADN va être analysé par hybridation. Mais le support de nylon est remplacé par un support non poreux, du verre, sur lequel la micro technologie permet de déposer de l'ADN en des points précis et en quantité précise. La densité de ces arrangements va de plusieurs centaines à plusieurs dizaines de milliers de cibles (cela dépend de la méthode utilisée pour les fabriquer).

Trois étapes constituent l'usage des puces à ADN.

1. Préparation de la puce, ce qui implique de choisir l'acide nucléique le plus approprié à se lier à un support solide, ainsi que la méthode de construction de la puce. (dépôts physiques ou synthèse in situ des différents oligonucléotides-méthode photolithographique)
2. La préparation de la sonde marquée par des fluorochromes et son hybridation (souvent c'est de l'ARN qui est converti en ADNc).
3. La saisie des données et leur analyse.

Dans le cas des ADN déposés physiquement on peut utiliser différents types d'ADN

• des fragments de gènes
• des amplifiats obtenus avec des amorces très dégénérées et qui contiendront une bonne partie du génome
• des EST (petits fragments de gènes identifiés par une ORF, Expressed Short Tag). Ces fragments ont été obtenus à partir d'une banque d'ADNc .
• etc.

Une puce contenant 10000 cibles mesure 50 x 100 microns.

Figure 3-14. Préparation d'une puce par photolithographie.

La méthode photolithographique permet de fixer de petits oligonucléotides avec une grande densité. Pratiquement dans ce cas, on inclut plusieurs marqueurs pour le même gène, pour éviter, entre autre, les erreurs.

Quelque soit sa méthode de construction, une puce avec des oligonucléotides donne une meilleure résolution, une meilleure hybridation et une bonne capacité de détection des SNP.

Par rapport aux méthodes classiques d'hybridation, les puces permettent de traiter de nombreux échantillons et contrôles simultanément.

Ces puces permettent

• de comparer le génome de deux populations de cellules l'une saine et l'autre cancéreuse par exemple.
• de faire l'inventaire des gènes exprimés dans un tissu donné.
• l'identification de souches pathogènes telles que l'influenza, la malaria ou E. coli
• de caractériser un génome (séquence, marqueurs de chaque chromosome homologue, etc.)
• de détecter des SNP

Détection de novo des SNP

Figure 3-15. Représentation schématique d'une portion de puce à ADN. L'ADN analysé est marqué par un fluorochrome (. Ici, seules deux formes de sondes ont été représentées :TCGGAG ou TCAGAG. Le sujet qui a fourni l'ADN ne porte que la forme G et pas A, il est homozygote G/G.

Pour la détection de nouveaux SNP on utilise des oligonucléotides (15 à 20 nucléotides de long) qui ont la séquence exacte d'une portion du gène, sauf pour le nucléotide central qui peut être n'importe laquelle des 4 bases. Il faut donc 4 oligonucléotides à chaque position explorée.

L'ADN d'un individu est fragmenté et marqué avec un fluorochrome puis hybridé avec l'ADN fixé sur la puce. Seuls les fragments qui trouvent la séquence exactement complémentaire sont retenus. Après lavage pour éliminer l'ADN fluorescent en excès, on analyse les oligonucléotides qui ont retenu de la fluorescence. Ce qui permet de déterminer quelle est la séquence exacte pour le gène correspondant.

Dans la figure 3-15 une seule des deux sondes représentées fluoresce. L'individu possède donc la même forme pour la position explorée sur chacun de ses chromosomes homologues, il est homozygote.

Une puce pouvant contenir plusieurs dizaines de milliers de sondes permet d'explorer rapidement le génome.

Figure 3-16 Microphotographie d'une puce à ADN après hybridation. Les sondes qui ont retenu l'ADN marqué émettent une fluorescence verte

Détection des SNP connus

La plupart de ces méthodes (comme celle des puces à ADN que nous venons de voir) sont basées sur la capacité de l'ADN d'être dénaturé en simple brin par la chaleur et de se renaturer en refroidissant dans des conditions précises avec un brin dont la séquence est complémentaire.

Hybridation Allèle Spécifique

Méthode connue également sous le nom de Allele Specific Oligonucleotide hybridisation (ASO). On utilise deux sondes oligo nucléotidiques courtes qui ne diffèrent que par un nucléotide. L'ADN du sujet est hybridé avec séparémebnt avec chacune de ces deux sondes marquées. L'ADN génomique n'hybride qu'avec la sonde dont la séquence lui est parfaitement complémentaire.

Figure 3-17. Différence entre la séquence de b globine normale (A) et mutante (S) de l'anémie falciforme et identification de chaque allèle par ASO.

Extension d'amorce

L'ADN de la région qui contient le SNP est amplifié par PCR avec une paire d'amorces spécifiques (S1 et S2). Le produit de PCR est purifié et une sonde oligonucléotidique (S3) qui se termine en 3' juste avant le SNP est utilisée pour un mini séquençage . Dans deux tubes on place

• du produit de PCR
• la sonde S3
• la polymérase
• soit le dNTP marqué correspondant à la forme sauvage du SNP
• soit le dNTP marqué correspondant à la forme mutée du SNP

On analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et autoradiographie le produit des deux tubes. Seul le dNTP complémentaire du nucléotide présent au ras de l'amorce permet que celle ci soit allongée et donc marquée (radioactivement ou par fluorescence).

Figure 3-18. Identification de SNP par extension d'une amorce.

Ligation d' oligonucléotide allèle specific

La portion du gène qui contient le SNP est amplifié par PCR en prenant comme matrice l'ADN d'un sujet dont on veut déterminer le génotype.

On choisit un oligonucléotide complémentaire de la portion de séquence (O1) du gène qui se termine juste avant le site SNP et un autre qui contient le site SNP (O2)(sous une forme ou l'autre).

On essaie la ligation de O1 avec O2 en présence du produit de l'amplification. Elle aura lieu si O1 et O2 sont exactement complémentaires de la matrice amplifiée.

Séquençage

C'est la méthode de choix pour découvrir des SNP. Voir ci-dessus.

Modification de RFLP

Il peut arriver qu'une mutation touchant une base modifie un site d'enzyme de restriction soit en en faisant apparaître un nouveau soit en en faisant disparaître un qui existait dans la forme sauvage.

Figure 3-19. Identification de l'allèle S du gène de la globine par RFLP.

Fréquence

En moyenne un SNP est rencontré tous les 100 à 1000 nucléotides. Il y en a de l'ordre de 5 x 10⁶ dans le génome humain. Certaines associations de SNP sont caractéristiques de certaines populations.. La distribution des SNP est au hasard. Dans n'importe quel gène on peut attendre une moyenne de 10 SNP, mais certains peuvent n'en présenter aucun. En 2001 on avait recensé 800 000 SNP dans le génome humain.