Définition
Les SNP(Single Nucleotide
Polymorphism) constituent la forme la plus abondante de
variations génétiques dans le génome humain. Ils représentent
plus de 90% de toutes les différences entre individus. C'est
un type de polymorphisme de l'ADN dans lequel deux chromosomes
diffèrent sur un segment donné par une seule paire de bases.
Dans deux génomes humains
tirés au hasard, 99,9% de la séquence d'ADN est identique.
Les 0,1% restants contiennent des variations de séquence
dont le type le plus commun est le polymorphisme pour un
nucléotide (SNP). Les SNP sont stables, très abondants et
distribués uniformément dans tout le génome. Ces variations
sont associées à de la diversité entre populations ou individus,
une différence de sensibilité à des maladies et la réponse
individuelle aux médicaments.
Mise en évidence
De nombreux SNP ont été
mis en évidence lors de l'étude de sujets sains et malades
portant des allèles différents d'un gène donné.
Il existe aujourd'hui de
nombreuses méthodes pour mettre en évidence des différences
d'un nucléotide. Une des plus performante actuellement et
qui paraît offrir de grandes espérances est l'usage des
puces à ADN
Puces à ADN
La technologie des puces
à ADN s'inspire de la technique des analyses de gels en
Southern blot par hybridation. Ici encore l'ADN va être
analysé par hybridation. Mais le support de nylon est remplacé
par un support non poreux, du verre, sur lequel la micro
technologie permet de déposer de l'ADN en des points précis
et en quantité précise. La densité de ces arrangements va
de plusieurs centaines à plusieurs dizaines de milliers
de cibles (cela dépend de la méthode utilisée pour les fabriquer).
Trois étapes constituent
l'usage des puces à ADN.
- Préparation de la puce, ce
qui implique de choisir l'acide nucléique le plus approprié
à se lier à un support solide, ainsi que la méthode de construction
de la puce. (dépôts physiques ou synthèse in situ des différents
oligonucléotides-méthode photolithographique)
- La préparation de la sonde
marquée par des fluorochromes et son hybridation (souvent
c'est de l'ARN qui est converti en ADNc).
- La saisie des données et
leur analyse.
Dans le cas des ADN déposés
physiquement on peut utiliser différents types d'ADN
- des fragments de gènes
- des amplifiats obtenus avec
des amorces très dégénérées et qui contiendront une bonne
partie du génome
- des EST (petits fragments
de gènes identifiés par une ORF, Expressed Short Tag). Ces
fragments ont été obtenus à partir d'une banque d'ADNc .
- etc.
Une puce contenant 10000
cibles mesure 50 x 100 microns.
Figure 3-14. Préparation
d'une puce par photolithographie.
La méthode photolithographique
permet de fixer de petits oligonucléotides avec une grande
densité. Pratiquement dans ce cas, on inclut plusieurs marqueurs
pour le même gène, pour éviter, entre autre, les erreurs.
Quelque soit sa méthode de
construction, une puce avec des oligonucléotides donne une
meilleure résolution, une meilleure hybridation et une bonne
capacité de détection des SNP.
Par rapport aux méthodes
classiques d'hybridation, les puces permettent de traiter
de nombreux échantillons et contrôles simultanément.
Ces puces permettent
- de comparer le génome de
deux populations de cellules l'une saine et l'autre cancéreuse
par exemple.
- de faire l'inventaire des
gènes exprimés dans un tissu donné.
- l'identification de souches
pathogènes telles que l'influenza, la malaria ou E. coli
- de caractériser un génome
(séquence, marqueurs de chaque chromosome homologue, etc.)
- de détecter des SNP
Détection de novo des
SNP
Figure 3-15. Représentation
schématique d'une portion de puce à ADN. L'ADN analysé
est marqué par un fluorochrome (. Ici, seules deux formes
de sondes ont été représentées :TCGGAG ou TCAGAG. Le sujet
qui a fourni l'ADN ne porte que la forme G et pas A, il
est homozygote G/G.
Pour la détection de nouveaux
SNP on utilise des oligonucléotides (15 à 20 nucléotides
de long) qui ont la séquence exacte d'une portion du gène,
sauf pour le nucléotide central qui peut être n'importe
laquelle des 4 bases. Il faut donc 4 oligonucléotides à
chaque position explorée.
L'ADN d'un individu est fragmenté
et marqué avec un fluorochrome puis hybridé avec l'ADN fixé
sur la puce. Seuls les fragments qui trouvent la séquence
exactement complémentaire sont retenus. Après lavage pour
éliminer l'ADN fluorescent en excès, on analyse les oligonucléotides
qui ont retenu de la fluorescence. Ce qui permet de déterminer
quelle est la séquence exacte pour le gène correspondant.
Dans la figure 3-15 une seule
des deux sondes représentées fluoresce. L'individu possède
donc la même forme pour la position explorée sur chacun
de ses chromosomes homologues, il est homozygote.
Une puce pouvant contenir
plusieurs dizaines de milliers de sondes permet d'explorer
rapidement le génome.
Figure 3-16 Microphotographie
d'une puce à ADN après hybridation. Les sondes qui ont
retenu l'ADN marqué émettent une fluorescence verte
Détection des SNP connus
La plupart de ces méthodes
(comme celle des puces à ADN que nous venons de voir) sont
basées sur la capacité de l'ADN d'être dénaturé en simple
brin par la chaleur et de se renaturer en refroidissant
dans des conditions précises avec un brin dont la séquence
est complémentaire.
Hybridation Allèle Spécifique
Méthode connue également
sous le nom de Allele Specific Oligonucleotide hybridisation
(ASO). On utilise deux sondes oligo nucléotidiques courtes
qui ne diffèrent que par un nucléotide. L'ADN du sujet est
hybridé avec séparémebnt avec chacune de ces deux sondes
marquées. L'ADN génomique n'hybride qu'avec la sonde dont
la séquence lui est parfaitement complémentaire.
Figure 3-17. Différence entre
la séquence de b globine normale (A) et mutante (S) de l'anémie
falciforme et identification de chaque allèle par ASO.
Extension d'amorce
L'ADN de la région qui contient
le SNP est amplifié par PCR avec une paire d'amorces spécifiques
(S1 et S2). Le produit de PCR est purifié et une sonde oligonucléotidique
(S3) qui se termine en 3' juste avant le SNP est utilisée
pour un mini séquençage . Dans deux tubes on place
- du produit de PCR
- la sonde S3
- la polymérase
- soit le dNTP marqué correspondant
à la forme sauvage du SNP
- soit le dNTP marqué correspondant
à la forme mutée du SNP
On analyse par électrophorèse
sur gel de polyacrylamide et autoradiographie le produit
des deux tubes. Seul le dNTP complémentaire du nucléotide
présent au ras de l'amorce permet que celle ci soit allongée
et donc marquée (radioactivement ou par fluorescence).

Figure 3-18. Identification
de SNP par extension d'une amorce.
Ligation d' oligonucléotide allèle
specific
La portion du gène qui contient
le SNP est amplifié par PCR en prenant comme matrice l'ADN
d'un sujet dont on veut déterminer le génotype.
On choisit un oligonucléotide
complémentaire de la portion de séquence (O1) du gène qui
se termine juste avant le site SNP et un autre qui contient
le site SNP (O2)(sous une forme ou l'autre).
On essaie la ligation de
O1 avec O2 en présence du produit de l'amplification. Elle
aura lieu si O1 et O2 sont exactement complémentaires de
la matrice amplifiée.
Séquençage
C'est la méthode de choix
pour découvrir des SNP. Voir ci-dessus.
Modification de RFLP
Il peut arriver qu'une mutation
touchant une base modifie un site d'enzyme de restriction
soit en en faisant apparaître un nouveau soit en en faisant
disparaître un qui existait dans la forme sauvage.
Figure 3-19. Identification de l'allèle S du gène de la
globine
par RFLP.
Fréquence
En moyenne un SNP est rencontré
tous les 100 à 1000 nucléotides. Il y en a de l'ordre de
5 x 106 dans le génome humain. Certaines associations
de SNP sont caractéristiques de certaines populations..
La distribution des SNP est au hasard. Dans n'importe quel
gène on peut attendre une moyenne de 10 SNP, mais certains
peuvent n'en présenter aucun. En 2001 on avait recensé 800
000 SNP dans le génome humain.
Chromosome |
nombre de SNP |
Chromosome |
nombre de SNP |
Chromosome |
nombre de SNP |
1 |
16759 |
9 |
5790 |
17 |
6392 |
2 |
12748 |
10 |
6014 |
18 |
2682 |
3 |
10112 |
11 |
6931 |
19 |
7664 |
4 |
6995 |
12 |
7375 |
20 |
5381 |
5 |
9146 |
13 |
2847 |
21 |
3478 |
6 |
13888 |
14 |
5827 |
22 |
5400 |
7 |
12389 |
15 |
4343 |
X |
3253 |
8 |
4962 |
16 |
5771 |
Y |
63 |
|
|
|
|
Total |
177594 |
Tableau 3- 6 . Répartition des SNP connus sur les chromosomes humains.